黄牛和犏牛睾丸组织中减数分裂同源重组基因表达、克隆与启动子区甲基化分析

【摘要】黄牛和牦牛的种间杂交后代的杂种优势非常明显,但由于生殖隔离而造成F1代公犏牛雄性不育。研究发现F1代犏牛雄性不育主要是由精母细胞减数分裂障碍引起的,联会复合体不能正常形成。在减数分裂同源染色体联会前,同源重组已经启动,但目前关于犏牛减数分裂同源重组方面的研究还未见报道。为了探索犏牛雄性不育与减数分裂同源重组之间的关系,本试验拟采用Real-timeqPCR技术检测犏牛与其父本(黄牛)睾丸组织中减数分裂同源重组关键基因(Spoll,Meil,Dmcl、Rad51、Msh4、Msh5、Mlh1和Exol)mRNA表达水平；采用生物信息学方法比较黄牛和犏牛差异表达基因编码区序列,分析序列特征。实验室前期研究发现犏牛睾丸组织基因组和印记基因异常甲基化,印记基因表达异常,基因组甲基化异常可能是导致犏牛雄性不育的主要原因之一。为了进一步揭示甲基化与犏牛雄性不育的关系,本试验拟采用亚硫酸氢盐测序技术检测黄牛和犏牛睾丸组织中差异表达基因启动子区甲基化水平,采用荧光素酶双报告基因系统和体外甲基化技术筛选差异甲基化基因核心启动子区,分析启动子区甲基化对基因表达的调控作用,以期为阐明犏牛雄性不育的机制提供理论依据。全文主要研究结果如下：1.黄牛和犏牛睾丸组织中减数分裂同源重组基因mRNA表达水平通过Real-timeqPCR检测发现,减数分裂障碍、雄性不育的犏牛睾丸组织中减数分裂重组基因(Spoll、Meil、Dmcl、Rad51、Msh4、Msh5、Mlhl和Exol)mRNA表达水平均低于减数分裂正常的黄牛。犏牛睾丸组织中Spoll、Meil、Dmcl、Msh4和Mlhl等5个基因mRNA表达水平极显著低于黄牛(P<0.01),Msh5和Exol基因mRNA表达水平显著低于黄牛(P<0.05),推测睾丸组织中Spoll、Meil、Dmcl、Msh4、Msh5、Mlhl和Exol基因mRNA表达水平可能与犏牛雄性不育有一定的关系。而黄牛和犏牛睾丸组织中Rad51基因mRNA表达水平差异不显著。2.黄牛和犏牛5个差异表达的同源重组基因的克隆和分析通过克隆测序技术对黄牛和犏牛睾丸组织中mRNA表达水平差异极显著的5个同源重组基因(Spoll、Meil、Dmcl、Msh4和Mlhl)编码区进行了了克隆与分析,结果发现黄牛和犏牛Spoll、Meil、Dmcl、Msh4和Mlhl基因编码区序列全长分别为1188bp、3837bp、1023bp、2785bp和2294bp,两者核苷酸序列完全一致,且与哺乳动物其它物种具有较高的同源性。电子染色体定位发现Spoll、Meil、Dmcl、Msh4和Mlhl基因分别定位于13、5、5、3和22号染色体上,基因结构与哺乳动物其它物种相似。黄牛和犏牛Spoll、Meil、Dmcl、Msh4和Mlhl基因编码蛋白分别含有395、1278、340、934和758个氨基酸残基,氨基酸序列与哺乳动物其它物种具有较高的同源性,且与哺乳动物其它物种具有相同的典型结构域,说明黄牛和犏牛Spoll、Meil.Dmc1、Msh4和Mlh1基因与哺乳动物其它物种在进化上是相当保守的,推测它们在牛精子发生减数分裂同源重组过程中发挥重要作用。3.黄牛和犏牛睾丸组织中5个同源重组基因的启动子区甲基化分析启动子区CpG岛预测牛5个同源重组基因(Spoll、Msh4、Mei1、Dmc1、Mlh1和Exol)基因5’-调控区均含有CpG岛。采用亚硫酸氢盐测序(BSP)技术对黄牛和犏牛睾丸组织5个同源重组基因(Spoil、Msh4、Meil、Dmcl、Mlh1和Exol)基因启动子区DNA甲基化状态进行了分析,结果发现犏牛睾丸组织Spoll、Meil、Dmc1和Msh4基因启动子区甲基化水平均高于黄牛,其中Spoll、Meil和Msh4基因在犏牛睾丸组织中的甲基化水平极显著高于黄牛(P<0.01),Dmc1基因在犏牛睾丸组织中的甲基化水平则显著的高于黄牛(P<0.05),而黄牛和犏牛睾丸组织中Mlhl基因的启动子区甲基化水平均很低,且差异不显著。4.核心启动子区甲基化对黄牛Spoll和Msh4启动子区活性的影响以黄牛和犏牛睾丸组织中甲基化程度差异极显著的Spoll和Msh4基因为研究对象,分析启动子区甲基化对黄牛减数分裂同源重组基因的调控作用。采用BSP技术对黄牛肝脏组织(不表达Spoll和Msh4基因)中Spoll和Msh4基因启动子区甲基化水平进行了检测,结果发现黄牛肝脏组织中Spoll和Msh4基因启动子区甲基化水平(96.25%、67.39%)均极显著高于睾丸组织,进一步证明黄牛Spoll和Msh4启动子区甲基化与其表达有密切关系。构建了4个黄牛Spoll基因双荧光素酶缺失表达载体和3个Msh4基因双荧光素酶缺失表达载体,分别转染GC-1和COS-7细胞,结果发现在黄牛Spoll基因核心启动子区位于-62nt～-293nt,Msh4基因核心启动子区位于-8nt～-160nt。为了进一步研究核心启动子区甲基化对Spoll和Msh4基因表达的影响,采用M.SssI甲基转移酶对核心启动子区双荧光素酶表达载体进行体外甲基化修饰,瞬时转染GC-1细胞,结果发现甲基化修饰后黄牛Spoll和Msh4基因核心启动子区活性均极显著降低(P<0.01),说明核心启动子区甲基化对黄牛Spoll和Msh4基因的表达具有调控作用。
【作者】骆骅；
【导师】李齐发；
【作者基本信息】南京农业大学，动物遗传育种与繁殖，2013，硕士
【关键词】黄牛；犏牛；雄性不育；睾丸组织；基因表达；启动子区；甲基化；

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