萝卜硫苷合成代谢关键基因克隆与表达特征分析

【摘要】萝卜(RaphanussativusL.)是一种重要十字花科蔬菜作物,具有较高的食用和药用价值。硫代葡萄糖苷(简称硫苷)中的4-甲基亚磺酰丁基硫苷(Glucoraphanin,RAA)的水解产物萝卜硫素(Sulforaphane,SF)是到目前为止在蔬菜中发现的抗癌效果最强的活性物质之一。硫苷是十字花科蔬菜中的一类重要次生代谢产物,硫苷及其降解产物具有抗虫、影响风味和抗癌等作用。近年来随着对拟南芥和白菜基因组全序列测定的完成,人们对硫苷的生物合成代谢途径及相关重要基因有了较为深入的了解,但是目前未见在萝卜中有关硫苷合成调控基因的报道。本论文克隆了脂肪族硫苷合成代谢过程中相关重要基因序列及其启动子序列,并对其中部分基因在萝卜中的表达特性进行了初步研究,以期通过基因改良工程或表达调控手段选育高硫苷含量的萝卜新品种奠定理论基础。本研究的主要结果如下1.利用电子克隆法从十字花科蔬菜萝卜中分离获得硫苷合成代谢过程中RsBCAT4、RsUGT74B1、RsGS-OX1的3个关键基因序列。将得到基因的开放阅读框序列及推导的氨基酸序列与GenBank中已公布相应序列进行同源性比较构建系统进化树。另外利用半定量及荧光定量PCR技术研究其在不同发育时期(不同部位)的表达情况；此外,利用荧光定量PCR技术对不同处理(伤害,MeJA)下的萝卜叶片进行表达分析。结果表明RsBCAT4在幼苗期(叶、茎、根)均表达,在膨大期和成熟期根部基本不表达,RsUGT74B1在幼苗期、在膨大期和成熟期表达量均很低RsGS-OX1在正常情况下表达量很低,但这三个基因在WO、MeJA处理后表达量均明显增大。2.利用电子克隆法分离获得RsCYP79F、RsCYP83A1、RsSUR1和RsSOT18基因的cDNA及DNA序列；同时应用染色体步移法分离获得这四个基因的启动子序列。用PLACE、PlantCARE在线预测工具分析表明：其序列含有启动子特定调控元件(如TATA-box,CAAT-box等),还有一些顺式调控元件(如MYB结合位点、ABA响应元件、GA响应元件、MeJA响应元件、光响应元件等)和一些其它调控元件,这说明这四个基因的表达可能受这些因素的调控。3.利用电子克隆法分离获得RsMyr1和RsMyr2基因cDNA及DNA序列；同时利用染色体步移法分离获得RsMyr2基因启动子序列。用PLACE、PlantCARE在线预测工具分析表明：其序列含有启动子的特定调控元件,(如CAAT-box,TATA-box等),还有一些顺式调控元件(如MYB结合位点、ABA响应元件、GA响应元件、茉莉酸响应元件、光响应元件)和一些其它的调控元件,说明萝卜RsMyr2基因的表达可能受这些因素调控；另外将RsMyrl和RsMyr2基因成熟编码区(去除信号肽)连接到表达载体pET-30α,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,产生了比预期大约8%的重组蛋白。最后构建了RsMyr2的过表达载体。研究结果为评价萝卜黑芥子酶分子特征和生物学功能提供了理论基础。
【作者】潘艳；
【导师】龚义勤；柳李旺；
【作者基本信息】南京农业大学，蔬菜学，2013，硕士
【关键词】萝卜；硫代葡萄糖苷；生物合成；基因克隆；启动子克隆；表达分析；

【参考文献】
[1]万熊熊.宽带分数分频频率综合器中电荷泵和分频器设计[D].复旦大学,集成电路工程,2012,硕士.
[2]陈芮.企业社会责任的法律研究[D].云南财经大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[3]高存泉.论紧缩货币政策对商业银行信贷业务的影响[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[4]刘杨.基于决策树与混合像元分解的朝鲜土地利用/覆盖分类研究[D].东北师范大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[5]闫凯.北京太庙建筑研究[D].天津大学,建筑设计及其理论,2004,硕士.
[6]向继.坚固网关系统研究[D].中国科学院研究生院（电子学研究所）,2003.
[7]陈楚天.周代邓国、邓县的历史与文化[D].华中师范大学,区域文化史,2014,硕士.
[8]张奇.论蒙古族传统文化在草原旅游纪念品专卖店设计中的应用[D].内蒙古师范大学,艺术设计学,2013,硕士.
[9]赵恩超.天津市生态小城镇建设研究[D].河北工业大学,技术经济及管理,2004,硕士.
[10]白丽君.论我国民事撤诉制度的完善[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[11]张康康.盈余漂移现象在中国A股市场的实证检验[D].上海交通大学,金融,2013,硕士.
[12]李琳.草酸铈与姜辣素止呕及抗癌增效作用研究[D].青岛大学,药理学,2013,硕士.
[13]姜丽丽.声脉冲辐射力成像技术对甲状腺良、恶性结节的鉴别诊断价值[D].山东大学,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[14]余珊.脂肪组织Nlrp3炎性体改变在追赶生长胰岛素抵抗形成中的作用[D].华中科技大学,内科学,2013,硕士.
[15]蒋本福.基于H桥高效率升压/降压DC-DC转换器设计[D].华侨大学,电子科学与技术,2014,硕士.
[16]王爽.民办高校大学生学习行为研究[D].辽宁师范大学,教育学原理,2011,硕士.
[17]郭研.网络伪民意分析[D].辽宁大学,传播学,2012,硕士.
[18]周炫成.不同波浪环境下航行体出水过程模拟及载荷特性分析[D].哈尔滨工业大学,动力机械及工程,2014,硕士.
[19]倪新初.前列腺癌MRI动态增强与组织病理学相关性研究[D].苏州大学,影像医学,2003,硕士.
[20]倪叶辉.上海市外来从业人员养老保险制度研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2012,硕士.
[21]宋艳.酪蛋白溶解过程及其聚集状态研究[D].广西大学,化学工艺,2004,硕士.
[22]王荣.配基的杂泛性的机制分析[D].华中农业大学,基因组学,2014,硕士.
[23]焦艳东.带约束的Tikhonov正则化方法的应用[D].河北工业大学,应用数学,2004,硕士.
[24]叶超.空冷及蒸发冷却条件下电机定子温度场研究[D].中国科学院研究生院（电工研究所）,电机与电器,2004,硕士.
[25]马金英.张景岳论治痰证的学术思想研究[D].甘肃中医学院,中医医史文献,2014,硕士.
[26]蔡红,王宁.试析数字产品的定价策略[J].商场现代化,2014,04:95-96.
[27]张杨.谢瑞麟公司ETA产品定位策略研究[D].北京工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[28]王利华.武安市出租车行业中政府管制研究[D].西南交通大学,行政管理,2014,硕士.
[29]李玉娟.三维虚拟地理场景的设计与实现[D].郑州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[30]董兰兰.共吡喹酮衍生物抗日本血吸虫生物学效应及吡喹酮耐药虫体差异表达蛋白的筛选[D].苏州大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[31]梁成.南京河西新城区城市管理的绩效评价研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[32]任春霞.贵州省部分少数民族妇女与汉族宫颈癌中端粒酶扩增和表达与HPV感染的相关性研究[D].遵义医学院,妇产科学,2012,硕士.
[33]薛珊燕.几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究[D].湖南师范大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[34]魏来.辽宁省“211工程”高校体育课程内容设置的调查研究[D].东北师范大学,体育（专业学位）,2012,硕士.
[35]陈刚.大型双进给珩磨头的刚度优化[D].兰州理工大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[36]任韬.保险博弈模型的仿真检验[D].首都经济贸易大学,数量经济,2004,硕士.
[37]王鹏飞.弯曲振动压电超声换能器机电耦合模型的研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[38]赵齐羽,蒋天安,陈芬,叶争渡,李琚,邓壮.肝内胆管细胞癌的超声造影表现分析[J].肿瘤影像学,2014,01:5-7.
[39]鲍文,于达仁,王伟,徐志强.基于关联规则的火电厂传感器故障检测[J].中国电机工程学报,2003,12:173-177.
[40]李卉.水溶性稀土氟化物纳米晶的制备[D].吉林大学,集成电路工程,2013,硕士.
[41]邱瑛.Web2.0技术在网络教学平台中的研究与应用[D].北京交通大学,2010.
[42]钱程.TNF-α对乳鼠心室肌细胞Cx43表达的影响[D].华中科技大学,心血管内科学,2013,硕士.
[43]董时军.生命科学两用性研究风险监管政策分析与启示[D].中国人民解放军军事医学科学院,军事预防医学,2014,博士.
[44]王晓云.明代中国、日本、琉球关系之研究[D].福建师范大学,专门史,2004,硕士.
[45]张玺科,杨春峰,牛新敏.用三维地震资料研究断层面的封堵性质[J].石油地球物理勘探,1997,05:731-739+750.
[46]许佩龙.丙泊酚麻醉对新生期大鼠认知功能发育的影响[D].南方医科大学,麻醉学,2012,硕士.
[47]丁帆.汽车召回风险的评价与控制研究[D].武汉理工大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[48]杨晓东.紫外光固化有机硅/SiO_2杂化涂层的制备及性能研究[D].南昌航空大学,材料工程（专业学位）,2012,硕士.
[49]张飞.基于价值链优化的G公司成本控制研究[D].安徽大学,工商管理,2014,硕士.
[50]陈华.面向多媒体存储的FAT文件系统研究与应用[D].华中科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.