猪OAS1启动子SNP对日本乙型脑炎病毒感染的影响

【摘要】流行性乙型脑炎（Japaneseencephalitis,JE,简称乙脑）是由日本乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV）感染所引发的一种人畜共患病,乙脑主要流行于东南亚地区,我国属于乙脑的高发地区。人感染乙脑主要出现脑炎症状,而猪感染会导致母猪流产和公猪睾丸炎,对养猪业造成极大危害。JEV在动物与人之间循环传播,带毒蚊子通过叮咬将JEV传播给人。猪是JEV的中间宿主和传播宿主,在乙脑的传播过程中起到重要作用,因此对于预防猪感染JEV在乙脑防治工作中具有重要意义。2’-5’寡腺苷酸合成酶（2’-5’oligoadenylatesynthetases,OAS）家族属于不依赖模板的RNA聚合酶家族,是干扰素诱导的抗病毒蛋白。OAS识别并结合病毒的双链RNA,合成2’-5’寡腺苷酸（2-5A）,依次结合并激活潜在的RNaseL,降解细胞内RNA和病毒RNA,抑制蛋白质的合成,这是经典的OAS/RNaseL途径,此外OAS还存在不依赖于RNaseL的抗病毒途径。自发现小鼠mOAS1b基因为WNV的风险标志基因以来,已报道OAS具有抑制脑心肌炎病毒、水疱性口炎病毒（VSV）、罗斯河病毒等多种病毒增殖的作用。人的OAS基因已被证实与西尼罗病毒（WNV）、丙型肝炎病毒（HCV）和SARS冠状病毒的易感性有关。研究表明马的OAS1启动子区SNP与个体WNV的易感性密切相关。介于目前尚无宿主遗传因素与JEV易感性的相关性研究。本研究目的是通过分析自然感染JEV发病猪与健康猪OAS1启动子基因序列的差异,研究猪OAS1单核苷酸多态性（SNP）与猪感染JEV发病表型的相关性。通过构建猪OAS1的真核表达载体,分析胞内pOAS1抗JEV感染作用,揭示猪OAS1基因是否为猪感染乙脑的风险标志基因。本研究主要从以下几个方面开展。1.猪源OAS1启动子的定位与功能测试本研究通过软件对比分析猪基因组序列（NC010456）,pOAS1mRNA（NM214303.1）和EST信息,确定猪OAS1基因转录起始位点是-155nt（ORF＋1ATG）.应用启动子分析软件,对比人和小鼠的OAS1启动子序列特征,设计特异性引物扩增OAS1启动子区。通过pGL3-Basic启动子活性检测载体,确定-1274至-34位的1241nt为猪OAS1的启动子区域,并通过设计该启动子区的分段引物连接载体。经干扰素刺激转染启动子测试载体的细胞,定位OAS1启动子的干扰素应答核心区域为-289至-34,256bp。通过对该区域的定点突变,确定了OAS1核心启动子区的2个ISRE/IRF结合位点。该研究为OAS基因启动子的分析及功能研究奠定了基础。2.猪源OAS1核心启动子区SNP特征本研究对收集的乙型脑炎发病猪、同群健康猪,地方和引进品种猪样品的OAS1核心启动子区的基因序列进行分析,证实猪OAS1启动子区的存在5个SNP位点的基因多态性,不同品种猪的SNP具有特征性。对发病猪与健康猪的OAS1核心启动子区的序列比较发现,在OAS1启动子区的-60位（C→A）和-264位（T→G）发病猪突变率高。通过比较SNP差异的乙脑发病猪与健康猪OAS1启动子活性的差异发现,无论6h还是24h乙脑发病猪启动子的基础活性都高于健康猪,但对干扰素应答的强度低于健康猪。乙脑发病猪单个SNP导致其对干扰素应答强度的降低。3.猪源OAS1在抗JEV感染中作用的初步探究本研究检测干扰素刺激对乙脑病毒增殖的影响和OAS1表达量的变化,以及比较乙脑病毒强毒株和弱毒株分别刺激PK细胞后OAS1表达量的变化。结果显示,猪α干扰素明显抑制JEV在PK15细胞上的增殖,并可诱导pOAS1的表达。JEV强毒株和弱毒株刺激PK细胞24h后,pOAS1的表达明显上升,但表达量低于强毒株刺激。而pOAS1启动子活性经JEV强毒株刺激6h活性上升,24h到达高峰,而弱毒株刺激6h启动子活性即到达高峰,24h活性下降。此外,同一毒株的接毒剂量对OAS1启动子活性和表达量的调控也有明显差异,高剂量有抑制作用,低剂量不能有效激活。比较乙脑发病猪OAS1启动子和健康猪对JEV刺激的应答差异,结果表明,乙脑发病猪对JEV感染的应答时间延后至24h,强度显著减弱。实验成功构建了真核表达载体pcDNA-pOAS1和pcDNA-pOAS1-EGFP,通过转染PK15细胞,发现pOAS1和pOAS1-EGFP都具有明显的抑制JEV增殖作用,且抗病毒作用与接毒剂量具有相关性,接毒量为MOI=0.1时OAS1抑制病毒增殖的效果最为显著,证实PK细胞中存在胞内OAS1抗JEV途径。
【作者】连雪；
【导师】陈溥言；曹瑞兵；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪OAS1启动子；SNP；猪OAS1；真核表达；抗病毒；

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