猪急性期蛋白表达分析及应激相关标志物的蛋白组学筛选

【摘要】本试验旨在筛选和验证猪血清及肝脏组织中蛋白质类应激指标,并寻找它们在不同应激模式下的变化规律,为畜牧业生产实际中监测动物应激、提高动物健康福利水平提供理论依据。试验选取健康断奶大白猪和二花脸猪以及杜长大三元杂交猪和淮猪进行品种间比较,分析了血液常规生理生化指标、血清急性期蛋白(APP)含量以及皮质醇、TNF-α等的浓度；分别研究了ACTH或LPS注射后猪肝脏和血清中APP基因和蛋白的表达情况,以及血液常规指标、血清皮质醇、TNF-α等的变化情况,并采用2-DE/MALDI-TOF质谱技术筛选了ACTH注射后的肝脏以及LPS刺激下猪的血清中可能存在的蛋白类生物标志物。1不同品种间猪急性期蛋白及其它应激相关指标的比较选取断奶(25d)大白猪5头、二花脸猪6头,屠宰后采集肝脏、血液样品；杜长大三元杂交猪生长期(40-50kg)13头、育肥期(80-90k)11头,生长期和育肥期淮猪各10头,于颈部静脉采集血液样品。采用荧光定量PCR、酶联免疫吸附法(Elisa法)和放射免疫检测法分析了各品种猪肝脏APP的基因表达和血清APP、皮质醇、TNF-α的浓度变化,采用自动生化分析仪对血细胞常规和常规生化指标进行了检测。结果显示：中国内地猪种与进口品种相比,有较高的(P<0.01)皮质醇和更低的(P<0.01)TNF-a水平,且淮猪生长期血清皮质醇浓度显著高于育肥期(P<0.05).APPs基因表达除二花脸猪HP有高于大白猪的趋势(P=0.093)外,其他APP均无显著变化；蛋白水平上,HP在淮猪和三元猪间表现出品种与生长阶段的双重差异(P<0.05),Pig-MAP在不同生长阶段间差异显著(P<0.05),二花脸猪HP、pig-MAP和TTR血清浓度显著高于大白猪(P<0.05)。血液常规指标三元杂交猪和淮猪的红细胞数目、红细胞压积及平均血红蛋白含量在品种和生长阶段均出现显著差异,淋巴细胞和中性粒细胞数目有品种差异(P<0.01),血小板数目在不同阶段间差异明显(P<0.05),淮猪均显著高于三元杂交猪。淮猪HDL-C显著高于三元杂交猪；而HDL-C表现正好相反,且生长期显著高于育肥期(P<0.01)；不同生长阶段比较,育肥期血清GSH-PX和SOD含量极显著低于生长期(P<0.01)。此外,对各项检测指标间的相关性进行分析：CRP与HP、Pig-MAP三者间显著相关,Pig-MAP与HDL-C相关性显著；红细胞数目、红细胞压积等血细胞指标之间有很强的关联(P<0.05),并且二者与皮质醇相关性显著(r值分别为0.38,0.47,P<0.05)。以上结果说明在同样的养殖条件下中国地方猪种所遭受的应激要小于引进品种,在胆固醇等物质代谢模式上显著优于外来猪种；同时所得试验数据证明了皮质醇、TNF-α和HP、Pig-MAP等作为动物应激标志物的实用性,为不同品种猪的生理特性的研究提供了重要的理论依据。2肌注ACTH对猪肝脏蛋白组学及应激相关指标的影响选取15-20kg的三元杂交猪(杜洛克×长白×大白)16头,分为ACTH注射组和自然对照组。试验组每天9：00和16：00两次肌内注射1IU/kgBW剂量ACTH,对照组注射等量生理盐水,试验时间7d。试验结束后,屠宰并采集肝脏和血液样品。采用荧光定量PCR、Elisa和放射免疫法分析了猪肝脏和血清中APP的基因与蛋白表达水平以及血清皮质醇和TNF-α含量。结果表明ACTH刺激后肝脏APP基因表达和血清皮质醇、TNF-α含量均无明显变化,仅血清HP浓度出现显著升高(P<0.01)。采用2-DE/MALDI-TOF技术进一步分析该模型下猪肝脏蛋白表达谱变化情况,结果从33个差异蛋白点中有32个得到阳性鉴定,它们代表27种不同蛋白质,涉及了物质代谢与运输、细胞功能和生长周期调控以及免疫防御等生理功能。揭示了长期慢应激状态下动物肝脏蛋白发生的一系列变化,为动物健康、福利筛选了新的监测指标,为减轻和避免动物应激以及后续的科学研究提供了一定的数据支持。3LPS注射后猪血清中应激标志物的筛选选取12头雄性杜长大三元杂交断奶仔猪(28d),随机分为两组,试验组肌内注射2mL含15μg/kg体重的LPS(E.Coliserotype,Sigma),对照组注射等量生理盐水。6h后屠宰并采集肝脏、血液样本。检测了肝脏APP的基因表达和血清中APP、TNF-α、皮质醇的表达水平,结果显示LPS注射组肝脏CRP、HP、Pig-MAP基因表达被显著上调,TTR显著下调(P<0.001)；血清中CRP、HP以及TNF-α.皮质醇的浓度显著上升(P<0.05)。对LPS注射后猪的体表温度和血清生化指标进行检测,结果表明体表温度和血清肌酸酐含量明显上升(P<0.05),血清白蛋白有下降的趋势(P=0.076)。以上应激指标的显著改变,证明该应激模式下机体发生了剧烈的生理反应,以抵抗LPS诱导产生的炎性刺激,帮助机体恢复健康稳态。采用2-DE/MALDI-TOF质谱技术分析了血清蛋白表达谱的变化情况,结果从18个差异显著的蛋白点中发现了10种不同蛋白质,它们大部分都属于经典的APP定义范畴,从而验证了急性应激状态下各种APP发生的显著改变。同时,发现一种新的应激指标,ZAG。在LPS诱导下ZAG表达量上升2倍以上,暗示ZAG可作为LPS刺激模式下一个潜在的应激生物标志物,但其具体机制还需要进一步的研究。
【作者】殷超；
【导师】杨晓静；
【作者基本信息】南京农业大学，基础兽医学，2013，硕士
【关键词】猪；生理生化指标；急性期蛋白；ACTH；2-DE；LPS；

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