猪流行性腹泻病毒S2基因片段重组猪痘病毒的构建和免疫原性分析

【摘要】猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是一种猪的肠道传染病,能引起感染猪出现呕吐、水样腹泻等症状,对哺乳仔猪具有较高致死率,给养猪业带来严重的经济损失。在我国,目前已有商品化的PED疫苗在广泛使用,但并未有效控制该病在我国的流行,且免疫效力有待提高。因此,研制一种更安全有效的疫苗十分必要。S蛋白位于PEDV的表面,含有病毒主要的抗原决定簇,在免疫反应中可以识别靶细胞上对应的受体,使病毒粒子结合于受体,通过膜融合使病毒粒子侵入宿主细胞,从而诱导宿主机体产生中和抗体,是研制PED疫苗的靶蛋白。为研制更安全有效的新型PED疫苗,利用RT-PCR方法扩增出PEDVS基因的第1360bp-1914bp基因片段(S1)和第250bp-831bp基因片段(S2),分别将其克隆至转移载体pUSG11/P28中构建重组转移载体pUSG11/P28-S1和pUSG11/P28-S2,脂质体介导重组转移载体与SPV基因组发生同源重组,经eGFP显性基因的筛选分别获得重组病毒rSPV-S1和rSPV-S2,并以rSPV-S1免疫小鼠制备抗体。结果显示,通过病毒中和试验证实小鼠体内产生抗PEDV的中和抗体；利用PCR、Westernblotting和IFA三种方法从rSPV-S2感染的PK-15细胞中均检测到表达的S2蛋白。因此,该重组猪痘病毒今后有望成为PED新型疫苗的候选疫苗。本研究利用RT-PCR方法扩增出PEDVS基因的第250bp-831bp基因片段(S2),将其克隆至转座质粒pFastBacHTA中,构建含S2基因片段的重组转座质粒pFastBacHTA-S2,并转化至E.coliDH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选和PCR方法鉴定得到含S2基因片段的重组穿梭载体(rBacmid-S2)DNA,经脂质体转染至Sf9昆虫细胞中,得到重组杆状病毒vBacmid-S2。利用SDS-PAGE和Westernblotting鉴定vBacmid-S2在Sf9昆虫细胞传3代后的细胞沉淀,结果显示在24kD处出现目的蛋白条带,IFA检测结果显示感染vBacmid-S2勺昆虫细胞出现特异性的绿色荧光。以上结果表明PEDV的S2基因片段通过杆状病毒得到有效表达,为研制PED亚单位疫苗提供了诊断抗原。
【作者】武存霞；
【导师】范红结；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪流行性腹泻病毒；纤突蛋白基因；重组杆状病毒；重组痘病毒；疫苗；

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