双重外排泵介导猪链球菌对环丙沙星耐药的机制研究

【摘要】猪链球菌的耐药现象日趋严重,其对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要集中于药物靶位的改变和外排泵的介导作用。本试验旨在以这两方面为切入点,重点探讨SatA和SatB外排泵在氟喹诺酮类耐药性中所起到的作用,以期为解释猪链球菌的耐药机制提供依据,具体研究内容如下：本文首先以实验室保存的临床分离猪链球菌敏感菌株和人工诱导对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的菌株为研究对象,测定了环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和氧氟沙星对亲本菌株和诱导菌株的最小抑菌浓度(MIC)；并测定了亲本菌株和诱导菌株的生长曲线；然后扩增和比对了诱导耐药菌株的拓扑异构酶Ⅱ(gyrA和gyrB)以及拓扑异构酶IV(parC和parE)的耐药决定区(QRDR)的基因突变；结果表明：人工诱导的9株猪链球菌菌株全部表现为对氟喹诺酮类抗菌药物耐药,MIC值分布于4-128μg/mL之间,生长曲线表明各诱导菌株的生长情况与其亲本敏感菌株相比无明显差异。部分耐药菌株不仅出现了经典的parC的Ser79Phe、gyrA的ser81Arg位点的突变,还出现了一些与文献报道一致的parE的Pro278Ser、gyrB的Asp315Asn、ser285Leu,点突变。此外,在诱导耐药菌株的gyrB基因靶位上还出现了一些不曾报道的突变和缺失,如Ser256Phe和Leu554Ser,以及288-291位的缺失。而耐药菌株JS12B与JS13B的gyrA、gyrB、parC和parE并未发生靶位点的突变,提示猪链球菌对氟喹诺酮类抗菌药物耐药性的形成可能还有其他机制的参与。实验进一步采用联用泵抑制剂利血平测定氟喹诺酮类抗菌药物对猪链球菌的MIC值、生长抑制试验以及环丙沙星蓄积试验检测了菌株中外排泵的存在与作用情况。当联用利血平后,环丙沙星对多数耐药菌株的MIC值下降了2-16倍,暗示耐药菌中存在与环丙沙星耐药相关的外排泵；在生长抑制试验中,加入利血平后耐药菌株在含有1/4×MIC浓度的环丙沙星中生长明显受到抑制,而敏感菌株的生长基本不受利血平的影响。此外,利血平可抑制耐药菌株在不同浓度的环丙沙星(从亚抑菌浓度到抑菌浓度)中的生长,尤其存在较低浓度的环丙沙星时,这种协同抑制作用更为明显,但利血平对敏感菌株在不同浓度的环丙沙星中的生长影响不显著。而后的药物蓄积试验显示了耐药菌与敏感菌对环丙沙星的蓄积差异。在利血平与环丙沙星联用时,耐药菌蓄积的盐酸环丙沙星含量显著高于单独使用环丙沙星时的蓄积量,且耐药菌泵出盐酸环丙沙星所需的时间延长,进一步佐证了猪链球菌中存在与环丙沙星耐药相关的外排泵。通过生物信息学分析,推测猪链球菌中SatA,SatB和SmrA为具有外排功能的蛋白,可能介导猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性,因此本实验又进一步采用荧光定量的方法测定了临床分离敏感菌与人工诱导耐药菌中编码外排泵的相关基因satA,satB以及smrA的mRNA表达水平,探讨其与环丙沙星耐药的相关性。结果显示,不含靶位点突变的菌株JS12B和JS13B与敏感菌株相比,satA和satB有92.4-421.7倍的高表达；含有靶位点突变的菌株JS14B和JS18B与敏感菌株相比,satA和satB的表达量有12.9-28.3倍差异。无论有无环丙沙星存在,耐药菌中satA和satB均存在着过表达现象,而smrA的表达量在敏感菌和耐药菌中的差异不显著。另外,环丙沙星诱导得到的耐药菌在含1/4xMIC浓度的环丙沙星中培养后,satA的表达量是不加药时的1.1-2.0倍,satB的表达量是不加药时的1.1-2.4倍；恩诺沙星诱导的耐药菌株JS18E2在1/4xMIC环丙沙星存在时,satA和satB的表达量相比较不加药时分别提高了1.76倍和1.64倍,而JS14E菌株在1/4xMIC环丙沙星存在时satA和satB的表达量分别下降了2.5倍和2.1倍,值得进一步研究。本研究结果进一步证实satA与satB的表达与猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性相关。最后,为了深入研究外排泵SatA和SatB在细菌耐药性中的功能,本实验又利用温敏自杀质粒pSET4s对satB基因进行定点敲除,以期构建satB的基因缺失株AsatB。本试验采用了氯霉素替代法以及融合PCR方法均成功地构建了缺失用自杀质粒,但是两个重组质粒电转进入猪链球菌菌株之后,都无法筛选到已经发生了同源重组的阳性缺失菌株,说明SatB对猪链球菌的生长有关键作用,因此SatB无法被人工敲除。
【作者】钱晓璐；
【导师】王丽平；
【作者基本信息】南京农业大学，基础兽医学，2013，硕士
【关键词】猪链球菌；环丙沙星；耐药性；外排泵；Real-timePCR；敲除；

【参考文献】
[1]汪大鹏.凝固条件对Mg-10Gd-3Y-0.7Zr合金组织和性能的影响[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2012,硕士.
[2]杨希.大学生批判性思维养成：课堂文化的视角[D].山东师范大学,高等教育学,2013,硕士.
[3]黎小伟.移动互联网时代小米手机竞争战略研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[4]李向欣,何山,王征,干永革,舒连峰,杜伟,李崇坚.交交变频同步电机的功率因数控制[J].冶金自动化,2001,01:43-44.
[5]丁啸林.基于改进FCM算法的暴力犯罪特征聚类分析及应用[D].大连海事大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[6]寿华梁.农业采摘机械臂关节伺服控制系统研究[D].浙江工业大学,2009.
[7]王雪平.供应链信任对合作绩效的影响研究[D].吉林大学,企业管理,2014,硕士.
[8]李乐.金属纳米线的批量制备及微纳米器件构筑研究[D].哈尔滨工业大学,2011.
[9]彭兰.政治关联、多元化战略与企业绩效[D].宁波大学,企业管理,2014,硕士.
[10]阴玥.46MHz可调谐高线性八阶G_m-C带通滤波器的设计与实现[D].西安电子科技大学,软件工程,2010,硕士.
[11]冀佩玮.北京市邮政物流网络布局优化研究[D].北京交通大学,2013.
[12]孙崇强.基于OFDM的水声通信关键技术研究[D].郑州大学,核技术及应用,2013,硕士.
[13]王德文.基于云计算的电力数据中心基础架构及其关键技术[J].电力系统自动化,2012,11:67-71+107.
[14]王征,任瑱.发达国家税收信息化概览及借鉴[J].税务研究,2002,12:72-73.
[15]亚历山大.中国飞速发展的奢侈品市场之挑战[D].浙江大学,中国学,2012,硕士.
[16]王钊.新型苯并咪唑类钳形铂化合物的合成及其光致发光性质研究[D].郑州大学,有机化学,2014,博士.
[17]刘冬梅.三鼎集团信息化管理诊断及优化方案[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[18]李建峰.穴位埋线与针刺治疗慢性腰肌劳损的临床研究[D].成都中医药大学,针灸推拿学,2012,硕士.
[19]张义民.阿普尔批判教育理论课程观研究[D].山东师范大学,比较教育学,2013,硕士.
[20]黄鹏.烟草制丝加工过程参数分析与控制技术研究[D].湖南农业大学,烟草科学与工程技术,2012,硕士.
[21]冯大鹏,尚长沛.Cr元素含量对C-Cr-Mo-Ni系熔覆层焊材组织及性能的影响[J].热加工工艺,2015,07:82-84.
[22]吴丽.云南少数民族题材电影发展历程研究[D].云南大学,民族文化产业,2014,博士.
[23]黄韵玲.跨国公司对华直接投资研究[D].武汉理工大学,国际贸易学,2004,硕士.
[24]邵汉永,冯纯伯.二次型耗散线性离散系统的鲁棒性分析与控制[J].控制与决策,2005,02:142-146+190.
[25]郭秀娟.数据挖掘方法综述[J].吉林建筑工程学院学报,2004,01:49-53.
[26]郑彦涛.基于层次分析法的CRH380B动车组维修可靠性分析与研究[D].清华大学,工业工程（专业学位）,2013,硕士.
[27]刘杰.基于LabVIEW的航空机电计算机测试系统设计与开发[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[28]布佳宁.从“真空世界”的人性丧失看战后野间宏的思想[D].吉林大学,日语语言文学,2013,硕士.
[29]杨刚.大跨径PC连续刚构桥的空间受力分析[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[30]曹霁.从目的论视角评析温洽溢译本《追寻现代中国》[D].北京外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[31]陈雷.B超图像序列特征分析[D].河北工业大学,微电子学与固体电子学,2004,硕士.
[32]孙敏.基于矩阵体积的关系图聚类算法研究[D].吉林大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[33]蔡捷.我国体育用品业并购效应的财务分析[D].山东大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[34]曹建农,李德仁,关泽群.用马尔科夫网对多光谱遥感图像进行波段最优融合[J].测绘学报,2005,01:46-52.
[35]袁泽明.LaFeSi系合金室温磁热性能及循环稳定性研究[D].内蒙古科技大学,材料学,2013,硕士.
[36]郭帅.基础教育均衡化中教师聘任制研究[D].河北大学,教育学原理,2014,硕士.
[37]刘英葭.“游戏”理论视角下的网络互动性广告创意研究[D].上海师范大学,传播学,2013,硕士.
[38]赵伟杰,刘剑,谭平恒.三层石墨烯及其n型和p型插层化合物的制备和拉曼光谱表征[J].光散射学报,2011,04:329-335.
[39]王泉德,王先甲,王先培.数据集划分及关联规则挖掘[J].计算机工程,2003,21:18-19.
[40]阿丽亚·拜都热拉,玉米提·哈力克,塔依尔江·艾山,艾克热木·吾布力,喀哈尔·扎依木,金华.阿克苏市5种常见绿化树种滞尘规律[J].植物生态学报,2014,09:970-977.
[41]郑琦.某建筑火灾后的检测及加固分析[D].大连理工大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[42]杨倩.连作及栽培基质对菊花生长发育的影响[D].河南农业大学,园林植物及观赏园艺,2012,硕士.
[43]燕鹏.从晚清重臣到民国政要—孙宝琦研究[D].苏州大学,中国近现代史,2014,硕士.
[44]卢毅玲.论诗歌的“超文本”教学[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[45]黄凯.人体行为识别研究及其在水电站视频监控中的应用[D].浙江工业大学,2013.
[46]叶月明,姚根顺,赵昌垒,庄锡进,张华.利用地震干涉法衰减海底相关层间多次波[J].石油地球物理勘探,2015,02:225-231+1-2.
[47]李方华,侯玲玲,苏晓华,郑扬,庞全海,关伟军,马月辉.RNA干扰的研究进展及应用[J].生物技术通讯,2010,05:740-745.
[48]范国平.液压叉车变速箱体数控工艺优化[D].南昌航空大学,机械工程,2013,硕士.
[49]欧阳舒平.新闻策划的审美认识[D].湖南师范大学,文艺学,2004,硕士.
[50]王飞.吕祖谦的史学思想研究[D].河北大学,中国古代史,2014,硕士.