农药多残留酶联免疫分析方法研究

【摘要】有机磷类和拟烟碱类杀虫剂是农业生产中广泛使用的两类农药,主要用于防治水稻、玉米和蔬菜等作物上的害虫。这两类农药在农业生产中的不当使用已经严重危害到环境质量、农产品安全和人类健康。因此,针对这两类农药建立一种快速的、灵敏的残留分析方法具有重要的研究意义。多残留酶联免疫分析技术具有操作简便、快速,价格低廉,适宜现场监控和大量样品筛选等优点,在农药残留快速检测中发挥着重要的作用。本研究建立了三种农药多残留酶联免疫分析方法：①应用宽谱多决定簇抗体建立多残留间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA);②应用两种抗体建立多残留直接竞争酶联免疫分析方法(dc-ELISA)；③两种抗体混用建立多残留增强化学发光酶联免疫分析方法(ECL-ELISA).研究结果如下：应用宽谱多决定簇抗体建立多残留ELISA分析方法：合成对硫磷半抗原(P1)和吡虫啉半抗原(11),采用碳二亚胺法将P1和11依次与载体蛋白BSA偶联,制备得到多决定簇人工免疫原,以多决定簇免疫原免疫雄性新西兰大白兔,获得可同时识别对硫磷和吡虫啉的高亲和性宽谱多决定簇抗体。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究不同包被原、有机溶剂、离子强度和pH值在ic-ELISA中对抗体亲和作用的影响,确立了对硫磷和吡虫啉ic-ELISA法的工作条件。在最优工作条件下,建立方法的工作曲线,对硫磷ic-ELISA抑制曲线线性范围在0.0017～1.85mg/L,回归方程为Y=-19.785x+25.300,R2为0.9925,抑制中浓度IC50为0.056mg/L,最低检测限IC10为0.0005mg/L;吡虫啉ic-ELISA抑制反应曲线在0.11～25.70mg/L,回归方程Y=-25.418x+55.847,R2为0.9924,IC5o为1.700mg/L,最低检测限为0.0045mg/L.制备的抗体除了对氯噻啉有较大的交叉反应,与其他的有机磷类和拟烟碱类杀虫剂均无明显交叉。通过自来水、河水、土壤和甘蓝中的添加回收率试验验证建立的ic-ELISA分析方法的准确性,添加浓度为0.002-1.000mg/L(mg/kg),添加回收率在84.4～116.9%,变异系数为0.4～7.2%。本研究建立的ic-ELISA方法符合农药残留分析要求。应用两种抗体建立多残留dc-ELISA分析方法：通过将对硫磷抗体(Pab-P)和氯噻啉抗体(Pab-I)分别包被在酶标板的不同微孔中,建立多残留免疫分析方法。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究不同酶标抗体、有机溶剂、离子强度和pH值在dc-ELISA中对方法灵敏度的影响,确立了直接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件。在最优条件下,对硫磷的回归方程为Y=-19.895x+25.291,R2为0.988,检测范围0.0018～1.84mg/L,IC50为0.057mg/L,最低检测限为0.0005mg/L；甲基对硫磷的回归方程为Y=-23.006x+32.283,R2为0.986,检测范围0.0084～3.42mg/L,IC50为0.169mg/L,最低检测限为0.0031mg/L;氯噻啉回归方程Y=-20.587x+23.562,R2为0.974,线性范围为0.0018-1.498mg/L,IC50为0.0525mg/L,最低检测限为0.0006mg/L;吡虫啉回归方程Y=-19.776x+24.784,R2为0.991,IC50为0.053mg/L,最低检测限为0.0005mg/L,线性范围为0.0016～1.745mg/L。该方法与其他的有机磷类和拟烟碱类杀虫剂均无明显交叉。通过河水、土壤和甘蓝样品中添加回收率对建立的方法进行准确性评估。添加浓度为0.005～0.500mg/L(mg/kg),添加回收率为82.5～116.3%,变异系数为1.6～8.1%。结果显示,建立的dc-ELISA方法符合农药残留分析要求。两种抗体混用建立多残留ECL-ELISA分析方法：混合应用氯噻啉抗体和噻虫啉抗体,筛选出抗体和酶标抗原的最适工作浓度,建立了应用一条标准曲线同时分析噻虫啉和氯噻啉的化学发光酶联免疫分析方法。回归方程Y=-33.609x-13.252,相关系数R2为0.988,工作浓度范围为0.0036～0.2750mg/L,最低检测限为0.0018mg/L。为了验证建立的ECL-ELISA分析方法的准确性,进行了番茄,甘蓝和稻米的添加回收率试验,添加浓度为0.04-0.25mg/L(mg/kg),添加回收率在83.7-109%,变异系数为2.0-5.8%。在方法的准确性研究中,应用番茄实际样品检测,高效液相色谱(HPLC)结果与ECL-ELISA的结果较一致(R2=0.996)。说明所建立的ECL-ELISA方法可以用于环境样品中氯噻啉和噻虫啉的快速定性及定量分析。本研究建立了三种农药多残留酶联免疫分析方法。三种方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求,可适用于大量样品和现场样品的快速检测,为开发多残留检测试剂盒奠定了基础。
【作者】闫旭；
【导师】王鸣华；
【作者基本信息】南京农业大学，农药学，2013，硕士
【关键词】有机磷类杀虫剂；拟烟碱类杀虫剂；宽谱多决定簇抗体；酶联免疫分析方法；化学发光酶免疫分析方法；多残留免疫分析；

【参考文献】
[1]陈浩勋.一类受控Petri网的状态反馈逻辑的综合[J].自动化学报,1996,05:576-581.
[2]徐焜耀,徐鑫,侯兴哲,胡致远.构建新一代智能配用电通信网建议[J].电力系统自动化,2013,10:1-5+18.
[3]季晓磊.基于人性假设的高校教师科研激励机制研究[D].青岛大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[4]肖晶.基于WAF的社区发现及用户推荐[D].北京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[5]王秀娟.活性氧调控血小板凋亡及辐射对产板型巨核Meg-01细胞影响的初步研究[D].苏州大学,放射医学,2014,硕士.
[6]张小伟.基于BCD工艺的恒流LED驱动芯片设计[D].西安电子科技大学,软件工程,2012,硕士.
[7]李宝莲.便携式专用设备维修系统研究与开发[D].西安电子科技大学,电子与通信,2008,硕士.
[8]周汇.好氧颗粒污泥的培养及其对污染物降解性能的研究[D].郑州大学,环境工程,2013,硕士.
[9]黄燕亭.铂基整体式催化剂在甲醛催化净化装置中的应用[D].广东工业大学,2014.
[10]谭勇,荣秋生.一个基于SLIQ的分类算法的实现[J].计算机工程,2003,18:98-100.
[11]蔡圣义,何勇.工件从大到小到达的带处理器费用的半在线调度算法[J].自动化学报,2003,06:917-921.
[12]张成昱,王平,赵仪,来强,孔黎.基于数据挖掘的网络信息资源管理系统分析、设计和实现[J].现代图书情报技术,2003,02:57-60.
[13]阿拉坦巴根.高校课堂教学心理契约的履行机制研究[D].东北师范大学,发展与教育心理学,2014,博士.
[14]薄晓宁.面向IMT-A的D2D系统通信机制优化的研究[D].北京交通大学,2014.
[15]张保明.克林顿政府的“信息高速公路”计划[J].信息与电脑.1994(01)
[16]张玲翔.战斧导弹发射系统的发展[J].飞航导弹.1992(11)
[17]邓雅晴.锰铈复合型非贵金属氧化物催化剂的制备、表征及CO氧化反应机理的研究[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[18]时晓章,金振奎,朱斗银,徐颖晶,杨雨.塔北隆起牙哈地区第三系储层特征[J].石油地球物理勘探,2009,S1:138-144+168+1.
[19]郑立平.论中学英语词汇教学[D].湖南师范大学,学科教学,2004,硕士.
[20]王东.盘锦市发展装备制造产业的对策研究[D].大连理工大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[21]茹亮.冷藏车远程感控系统关键技术研究[D].南京邮电大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[22]冉凌峰.云南与印度高等教育合作研究[D].云南师范大学,世界史,2013,硕士.
[23]李华伦.发射回收一体化空气炮性能研究[D].南京理工大学,航空宇航制造工程,2013,硕士.
[24]顾莺.学生政治及其对政治发展的影响[D].复旦大学,马克思主义理论与思想政治教育,2011,博士.
[25]王子强.成骨不全患者血清中骨相关microRNAs差异表达的研究[D].济南大学,微生物与生化药学,2012,硕士.
[26]邹春静,徐文铎.沙地云杉种内、种间竞争的研究[J].植物生态学报,1998,03:78-83.
[27]楚信强.膝下动脉球囊扩张成形术联合通络疽愈方治疗糖尿病足的临床观察[D].河北医科大学,中西医结合临床（专业学位）,2014,硕士.
[28]肖维妙.当前我国公务员主动退出的困境及其解决策略[D].湖南师范大学,行政管理,2014,硕士.
[29]乔晓芳,吴小俊,王士同,杨静宇.多尺度模糊加权角点检测新算法研究[J].控制与决策,2009,02:305-308+312.
[30]李中楠.面向物联网应用层的安全架构研究[D].大连海事大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[31]王西文,苏明军,徐尚成,王宇超,鲁烈琴,张喜梅,冯会元,刘志强.叠前地震反演在柴达木盆地三湖地区天然气预测中的应用[J].石油地球物理勘探,2008,03:300-307+370+22.
[32]袁东,王晓军,兰拓,曹旗,张双保.树皮人造板及相关建筑材料的制备和应用[J].林产工业.2004(03)
[33]赵海霞.我国中部地区武术馆校的学训机制研究[D].山西师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[34]王诗惠.木香软胶囊的研究[D].吉林大学,药物化学,2013,硕士.
[35]崔敬东.银行服务渠道多元化环境下的客户行为研究[J].国际金融研究,2005,08:69-73.
[36]陈园.“宽严相济”的刑事政策下未成人犯罪矫正处遇研究[D].安徽大学,刑法学,2014,硕士.
[37]陈丽贞.张喜奎导师辨治慢性肾炎的临床经验研究[D].福建中医药大学,中医内科学（专业学位）,2013,硕士.
[38]杨勇.亲代大鼠神经病理性疼痛对子代情绪行为学的影响及与杏仁核DNA甲基化的关系[D].中南大学,临床医学,2013,博士.
[39]卿丽萍.初成“新女性”（1900-1915）[D].首都师范大学,史学理论及史学史,2013,硕士.
[40]江建能.我国对俄边境口岸物流发展问题研究[D].北京交通大学,2007.
[41]卫育新.GPS/INS组合导航定位定向系统研究[D].西北工业大学,精密仪器及机械,2004,硕士.
[42]魏雪峰.欧洲共同基金业发展的影响因素研究[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[43]高畅.WTO框架下的社会倾销问题研究及中国应采取的对策[D].中国社会科学院研究生院,国际经济法（专业学位）,2014,硕士.
[44]王晓丹.邓恩的宗教诗：爱的多样表达[D].河北师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[45]李菊芳.建筑结构基于能量的地震反应分析及设计方法[D].西安建筑科技大学,结构工程,2004,硕士.
[46]索珂.保险公司顾客满意度测评体系研究及其实证分析[D].四川大学,2004.
[47]谷海彤,刘育权,熊文,黄欣,尹宜宜.地区电网能量管理系统安全技术改进建议[J].电力系统自动化,2012,18:166-170.
[48]周妮.基于音视频的双模态语音识别技术研究[D].北方工业大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[49]陈淑琴.苍附导痰丸加减治疗痰湿内阻型多囊卵巢综合征不孕症的临床观察[D].福建中医药大学,中医妇科学（专业学位）,2014,硕士.
[50]甘立琴.辽河坳陷清水洼陷深层有效储层特征及形成机制[D].东北石油大学,矿产普查与勘探,2013,硕士.