白背飞虱和灰飞虱蜕皮激素合成相关Halloween基因的克隆与功能验证

【摘要】蜕皮激素控制昆虫发育、繁殖等过程。蜕皮激素从胆固醇而生物合成。几个不同的由Halloween基因编码的细胞色素P450单加氧酶催化关键步骤。但蜕皮激素合成过程中涉及到的相关P450酶只在有限的几种昆虫中得到验证。RNA干扰(RNAi)技术可以通过沉默靶标基因而研究基因的功能。因此,导入dsRNA干扰昆虫体内内源基因的表达,进而研究此基因功能的方法在昆虫中得到广泛应用。本文搜索了重要的水稻害虫——灰飞虱和白背飞虱的转录组中蜕皮激素生物合成过程中相关的五个Halloween基因,采用RT-PCR、RACE技术获得了Halloween基因的cDNA全长；利用饲喂dsRNA的方法研究了Halloween基因被干扰后分别对灰飞虱和白背飞虱的生物学效应。研究结果总结如下。1.白背飞虱和灰飞虱蜕皮激素合成过程中相关Halloween基因的克隆通过RT-PCR和RACE技术,分别获得了白背飞虱和灰飞虱的5个Halloween基因的全长cDNA序列,并命名为SfCYP306A1、LsCYP306A1、SfCYP302A1、LsCYP302A1、SfCYP314A1、LsCYP314A1、SfCYP315A1、LsCYP315A1、SfCYP307A1和LsCYP307A1。其中SfCYP306A、LsCYP306A、SfCYP302A1、LsCYP302A1、SfCYP314A1、LsCYP314A1和LsCYP315A1有五个保守的P450区域,即WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERFmotif)和血红素结合区域PFxxGxRxCxG/A。而白背飞虱的CYP315A1仅获得部分序列,丢失了两个C端的保守区域,即PERF区域和血红素结合区域。SfCYP307A1和LsCYP307A1基因序列中,Helix-C和Helix-I并不是保守的,但是在昆虫中这些假定区域的序列非常相似。系统进化树分析将其分为CYP2分支和线粒体分支。前者包括CYP307A和CYP306A亚支,后者包括CYP315A1、CYP302A1和CYP314A亚支。2.白背飞虱和灰飞虱蜕皮激素合成过程中相关Halloween基因的表达动态分别测定了白背飞虱和灰飞虱的5个Halloween基因分别在4龄和5龄初期的表达量。在白背飞虱中,它们在四龄若虫的第一天和五龄若虫第一天都高表达,在四龄若虫的第二天和第三天,Halloween基因的表达水平急剧下降。在灰飞虱中,这5个Halloween基因在四龄若虫的第二天和第五天存在两个表达高峰,四龄若虫第一天和五龄若虫第一天存在两个表达低谷。因此可以推断,白背飞虱和灰飞虱Halloween基因时相表达模式与血淋巴中蜕皮激素的滴度一致。3.RNAi介导的Halloween基因功能验证以喂食dsRNA的方法对白背飞虱二龄若虫和灰飞虱四龄若虫进行RNAi实验,dsRNA浓度为0.5mg/ml,并连续喂食6和5天。qRT-PCR结果显示,与空白对照相比,灰飞虱和白背飞虱相应的Halloween基因和蜕皮激素受体基因(EcR)在mRNA表达水平均显著下降。RNAi引起若虫死亡并延缓若虫的发育；对白背飞虱和灰飞虱试虫cyp307al基因进行dsRNA干扰后,微量点滴20-羟基蜕皮酮进行补偿实验。结果显示,Sfcyp307al和Lscyp307al的表达水平没有提高,但是几乎完全恢复SfEcR和LsEcRmRNA的表达水平,并能补偿RNAi对若虫存活和发育带来的负面影响。因此,本文结果表明：昆虫蜕皮激素的生物合成是保守的,Halloween基因在蜕皮激素的生物合成过程中发挥了重大的作用。
【作者】贾爽；
【导师】李国清；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】白背飞虱；灰飞虱；蜕皮激素；Halloween基因；dsRNA干扰；

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