理化诱变提高乳酸菌STX2 γ-氨基丁酸产量的研究

【摘要】γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸,是哺乳动物神经系统中重要的抑制性神经递质。GABA具有降低血压、改善睡眠、促进生殖、预防和治疗癫痫、安神镇静等作用,在食品、医药及农业等方面具有广泛的应用前景。GABA的生产方法分为化学合成法、植物提取法及微生物发酵法。通过微生物发酵获取GABA,具有条件温和、供选菌株种类多、适合工业化等优点,近年来获得国内外研究人员的广泛关注。为了进一步提高GABA产量,本研究以南京农业大学保存的一株唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivariussubsp.thermophilus)STX2为出发菌株,进行理化诱变处理,包括紫外诱变、氮离子束注入、NTG诱变、LiCl诱变以及复合诱变。通过初筛和复筛得到高产GABA菌株,继而研究了高产突变菌株细胞制备GABA条件,研究结果如下：1.建立了纸层析定性初筛结合HPLC定量复筛,快速筛选出高产GABA菌株方法。纸层析定性检测GABA是以正丁醇、冰乙酸、水体积比4：1：3为展开剂,0.4%茚三酮为显色剂,5μL细胞转化液上样层析,根据GABA层析斑点大小和颜色深浅,快速排除了低产及不产GABA菌株。将初步筛选获得的高产菌株通过HPLC进一步检测GABA含量。以丹磺酰氯(DNS-C1)为衍生剂,C18为分离柱,梯度洗脱,检测波长254nm,结果细胞转化液中的GABA获得了很好的分离。建立了GABA系列标准曲线,GABA浓度在0-50mmol/L线性相关性好,回归方程为y=898.31x+1275,R2=0.9963.在该液相条件下,检测相对误差为7.4%,回收率为98.861%。证明该液相条件分析方法稳定、重复性好,可用于检测细胞转化液中GABA含量。2.通过紫外诱变、N+注入、NTG/LiCl诱变及复合诱变等手段对STX2进行理化诱变育种处理,通过初筛及复筛获取高产突变菌株并考察其稳定性。经过理化诱变处理,共筛选到高产菌株67株,选取其中18株进行稳定性检测,从中筛选到一株高产GABA且遗传稳定菌株NTG-5,其GABA转化率最高可达21.455±1.301mg/(g-h),较原始菌株(13.821±1.077mg/(g-h))提高了55.23%。3.通过单因素试验对影响GABA转化条件进行考察,确定Cu2+浓度、L-谷氨酸钠浓度、pH为关键因素,利用正交试验进一步得到了细胞转化GABA的最优条件组合为：30mL发酵液离心获得细胞,加入5mL初始pH4.5,含10mmol/L的CuCl2、200mmol/L的L-谷氨酸钠底物缓冲液,于45℃、180rpm摇床转化24h。测得GABA转化率为46.611±0.540mg/(g·h),较初始转化条件提高了1.20倍,较原始菌株STX2提高了2.36倍。
【作者】姜宏瑛；
【导师】陆兆新；
【作者基本信息】南京农业大学，食品工程，2013，硕士
【关键词】γ-氨基丁酸；理化诱变；转化条件；

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