猪肺炎支原体P65蛋白的克隆表达、单克隆抗体制备及阻断ELISA抗体检测方法建立

猪肺炎支原体P65蛋白的克隆表达、单克隆抗体制备及阻断ELISA抗体检测方法建立

作者:师大云端图书馆 时间:2018-08-14 分类:硕士论文 喜欢:2625
师大云端图书馆

【摘要】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS)的病原,给养猪业造成巨大的经济损失。由于缺乏对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白的深入研究,使得Mhp在致病机制、血清学检测方法和新型疫苗的研究发展上受到一定限制,从而影响了对MPS的控制。本试验利用原核表达系统表达了Mhp膜蛋白P65,并用该重组蛋白免疫小鼠,利用Mhp全菌蛋白和P65蛋白作为包被抗原进行ELISA筛选,制备抗P65单抗,然后使用该重组蛋白作为包被抗原,酶标单抗作为二抗,成功建立了单抗阻断ELISA检测方法。本研究主要从以下几个方面展开:1、根据GenBank公布的猪肺炎支原体(Mhp)P65基因序列,利用Primer5.0软件设计合成引物,通过PCR扩增目的基因,将含有三个稀有密码子的前922bp进行基因合成,剩余910bp通过PCR扩增出来,然后采用SOE-PCR方法将前段基因片段和后段基因片段连接起来,插入到表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)/P65.将重组质粒pET-32a(+)/P65导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经1%IPTG诱导表达3h后,蛋白的表达量最高,并用ProtinoNi-TED2000PackedColumns进行亲和纯化,得到较纯的目的蛋白。Western-blot分析表明表达蛋白具有良好的反应原性。2、本研究利用重组P65蛋白作为免疫原,利用P65蛋白、Mhp168株F350代全菌蛋白、空载体蛋白筛选能分泌P65蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了1株能稳定分泌抗P65蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G12。WesternBlot分析显示,3G12能与Mhp168株F350代全菌蛋白及大肠杆菌表达的P65重组蛋白产生反应,与空载体蛋白、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinitis)蛋白不产生反应。亚型鉴定显示,该抗体的重链为IgGl,轻链为k链。采用间接ELISA测得3G12腹水与P65蛋白反应的效价为1:4000000,与168全菌蛋白反应的效价为1:25600,腹水经商品化的ProteinG蛋白柱纯化得到纯度较高的单抗。3、本研究将重组表达的蛋白P65作为包被抗原,把纯化的单抗进行HRP酶标作为二抗,通过优化其反应条件成功建立阻断ELISA方法。用酶标仪读取各孔OD450nm值,按照以下公式计算阻断率:阻断率(percentageinhibition/PI)=(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450m值)/阴性血清OD450nm值×100%。通过对已知血清的检测,使用ROC标准曲线分析,当OD450为0.563,敏感性和特异性的和最大,即为临界值,此时阻断率为36.456%。当OD450<0.563时,血清为阳性;当OD450>0.563时,血清为阴性。同时试验证明,该方法与IDEXX试剂盒的符合率为92.92%,重复性较好,且与其他病原无交叉反应。可用于Mhp流行病学调查和疾病诊断。综上所述,本研究成功表达Mhp重组蛋白P65,获得了1株分泌MhpP65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G12,并成功建立了单抗阻断ELISA方法,从而为进一步研究Mhp致病机理以及建立Mhp血清学诊断方法奠定基础。
【作者】张悦;
【导师】邵国青;姜平;
【作者基本信息】南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士
【关键词】猪肺炎支原体(Mhp);P65蛋白;单克隆抗体;阻断ELISA方法;

【参考文献】
[1]孙长存.碳纳米管阵列制备及碳纳米管向金刚石的相变[D].南昌大学,2010.
[2]刘慧.山西庞庞塔井田地下水环境影响评价研究[D].中国地质大学(北京),地质环境与工程,2013,硕士.
[3]周小涵.参龟保肝升白蛋白丸对大鼠实验性肝硬化的影响及其机制研究[D].吉林大学,药理学,2013,硕士.
[4]刘硕.高清视频服务器磁盘I/O调度算法的研究[D].厦门大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[5]江以平.高速自动光电式外径无接触测定装置[J].冶金自动化,1981,04:42.
[6]项凤靖.戴·赫·劳伦斯对工业革命的回应[D].浙江大学,英语语言文学,2004,硕士.
[7]曹园缘.论跨文化因素对口译的影响及其策略[D].上海外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[8]孙毅.钴钒基锂离子电池纳米电极材料的制备及性能表征[D].中国科学技术大学,2013.
[9]王晓.在“新锐”的背后[D].苏州大学,现当代文学,2003,硕士.
[10]杨马英,王树青,王骥程,兰鸿森,陈清海,康飚.催化裂化反应再生系统的预测控制研究[J].自动化学报,1998,03:73-76.
[11]阳分胜.东莞樟木头镇麒麟舞的发展现状及出路探究[D].华中师范大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[12]于其超.复合土钉支护坡顶沉降影响因素数值模拟分析[D].山东建筑大学,岩土工程,2013,硕士.
[13]冮明颖.基于广义Tellegen定理的光伏并网系统的潮流算法研究[D].辽宁工业大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[14]吴志炜.生态数据分析系统的设计与实现[D].北京交通大学,2014.
[15]郑杰.分泌抗猪流感病毒(河南株)单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备、鉴定和初步应用[D].河南农业大学,预防兽医学,2004,硕士.
[16]段四喜.不同前茬对烤烟干物质累积的影响及其营养调控研究[D].云南农业大学,植物营养学,2013,硕士.
[17]张玲.控制权安排、会计师事务所选择与审计定价[D].云南财经大学,企业管理,2014,硕士.
[18]张嘉利.新型可盘旋型PVA人工髓核假体的实验研究[D].山西医科大学,骨外科学,2013,硕士.
[19]陈鸿硕.Müller交换泛函的下界估计[D].清华大学,数学,2013,硕士.
[20]张健敏.软件操作教程的典型句式结构汉译浅析[D].山东师范大学,翻译(专业学位),2013,硕士.
[21]马鸣图,吴宝榕.临界区加热时奥氏体的形成[J].云南工学院学报.1987(01)
[22]安树青.高一物理课堂无效学习时间研究[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[23]谢雅妮.论我国未成年人刑事案件社会调查制度[D].西北大学,法律(专业学位),2014,硕士.
[24]胡蓉.基于滑模观测器的永磁同步电机矢量控制研究[D].西南交通大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[25]高静怀,张兵.基于时频滤波的吸收衰减参数估算[J].石油地球物理勘探,2012,06:931-936+1024+840.
[26]郑姣姣.稀土氧化物-NaBO_2-Co/B储氢性能及显微结构的研究[D].长安大学,2014.
[27]方兴,郭志忠.配电网时变无功电压优化方法[J].电力系统自动化,2005,09:40-44+54.
[28]王梅英,王军,张益忠.乌克兰连铸上框架的装焊过程[J].一重技术.2006(06)
[29]赵丽军.FDI与企业开放式创新相关性研究[D].山东财经大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[30]邵轶超.北京地铁出入口站外广场景观设计研究[D].北京建筑大学,设计学,2013,硕士.
[31]刘伟圣.中国地级以上城市腹地的GIS测度[D].兰州大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[32]杨依如.物流企业财务预警系统研究[D].长安大学,会计学,2014,硕士.
[33]王中慧,冯建平,何建罡,李坚权.小砌块墙梁在周期荷载作用下的恢复力特性[J].华南理工大学学报(自然科学版).1992(02)
[34]刘国政.土壤化探在内蒙古新右旗宝格德乌拉区找矿中的应用及效果[D].石家庄经济学院,构造地质学,2014,硕士.
[35]张保勇.城市发展中的空间社会抗争及其治理[D].山东大学,行政管理,2013,硕士.
[36]王萍.喉乳头状瘤组织中热休克蛋白70的表达及临床意义[D].中国医科大学,耳鼻咽喉科学,2004,硕士.
[37]于建军,肖宏.CRTSⅢ轨道板模具设计与检测技术研究[J].铁道标准设计,2014,04:28-32.
[38]丁晓春.有序介孔碳的改性及其负载性能研究[D].南京航空航天大学,2011.
[39]钟麦英,DINGStevenX,汤兵勇,黄小原.一类不确定离散时间系统的鲁棒故障诊断滤波器优化设计方法[J].控制与决策,2003,05:600-603.
[40]李金钢.论政府利益对公众利益的负向效用及解决之道[D].苏州大学,行政管理,2012,硕士.
[41]张战.卵巢癌干细胞的分离、培养及其抗原鉴定[D].重庆理工大学,微生物与生化药学,2011,硕士.
[42]何洁.基于内部模拟市场化的高校后勤绩效考评体系构建研究[D].浙江工业大学,2013.
[43]李华一.基于隐式化方法的代数曲线拟合技术[D].吉林大学,计算数学,2014,硕士.
[44]遇彬.基于FPGA的精确时钟同步方法研究[D].浙江大学,2007.
[45]余思雨.“两型社会”城镇建设指标体系研究[D].华中科技大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[46]李锐,黄敏,王兴伟.基于混合概率解发掘算法的第四方物流弹复性网络设计[J].控制与决策,2013,10:1536-1540.
[47]黄桂林.高地应力矿柱受爆破扰动的动态响应研究[D].武汉理工大学,采矿工程,2013,硕士.
[48]林瑞芳.泰国大米出口竞争力研究[D].哈尔滨工业大学,国际贸易学,2013,硕士.
[49]张聪.论油画画面肌理的视觉美感[D].吉林大学,美术,2014,硕士.
[50]庞妍丽.葛兰西的霸权思想研究及其现代价值[D].扬州大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.

相关推荐
更多