稗草谷胱甘肽转移酶基因（EcGSTs）的克隆和表达分析

【摘要】杂草通过与油菜、水稻、小麦等作物竞争养分、水分、光照和空间等非生物因素,影响作物的产量和品质。除草剂的使用在减轻劳动强度和提高工作效率的同时,也可能会对作物产生伤害。目前,培育抗除草剂作物新品种是解决这一矛盾的关键。谷胱甘肽转移酶(GlutathioneS-transferases,GSTs;EC2.5.1.18)普遍存在于植物体内,在植物解毒代谢、逆境胁迫等方面有重要作用。恶性杂草—稗草的多抗性尤为突出,为了深入揭示其抗性机理,发掘抗除草剂基因。本研究从多抗性稗草(Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.)中,克隆得到两个GSTs基因(EcGSTZ1和EcGSTF1),并完成了生物信息学分析、原核表达分析、荧光定量分析和酶活性测定等工作,主要研究结果如下：1.EcGSTs:基因克隆：克隆得到的两个基因中,EcGSTZ1基因全长747bp,开放阅读框为639bp(含终止密码子),编码氨基酸212个,理论分子量为23.67KDa;EcGSTF1基因全长661bp,开放阅读框为645bp(含终止密码子),编码氨基酸214个,理论分子量为23.79KDa。经PSI-BLAST对比分析和系统发生树分析表明,EcGSTZ1基因属于Zeta家族,EcGSTF1基因属于Phi家族。2.原核表达分析：成功构建了pET28b-EcGSTF1和pET28b-EcGSTZ1勺表达载体,经IPTG诱导后,两种表达载体均获得表达,随着诱导时间的延长,表达量增加,表达条带大小和理论值相同。3.qPCR分析：以β-Actin基因作为内参,qPCR分析了除草剂处理前后不同抗性稗草的EcGSTs基因表达情况,发现两种基因均有表达；施药后表达量高于施药前,Phi类基因表达量高于Zeta类基因,多抗性稗草表达量高于敏感性陴草。这说明EcGSTs基因的表达与解毒代谢关系密切。4.GSTs活性测定：GSTs活性研究结果显示,施药处理前,多抗性稗草GSTs活性略高于敏感性稗草；施药后短时间内,两种稗草GSTs活性都呈下降趋势,敏感性稗草反应迟缓,多抗性稗草反应较迅速；随着时间的延长,多抗性稗草GSTs活性持续上升,而敏感性稗草GSTs活性呈先上升后下降趋势；最终多抗性稗草GSTs活性高于敏感性稗草。分析说明GSTs活性与杂草对除草剂的抗性有关,不同抗性稗草GSTs活性差异是引起除草剂代谢能力不同的重要原因。综上所述,通过:qPCR分析发现多抗性稗草EcGSTs基因表达量高于敏感性稗草,同时多抗性稗草GSTs酶活性高于敏感性稗草,说明GSTs基因对除草剂有解毒作用,并且克隆得到的两个EcGSTs基因可成功进行原核表达,为进一步解析GSTs基因在植物体内对外源有毒物质的解毒机制提供了重要基础。
【作者】王笑；
【导师】管荣展；
【作者基本信息】南京农业大学，作物，2013，硕士
【关键词】稗草；EcGSTs；基因克隆；原核表达；qPCR；

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