piggyBac转座子亚末端对转座活性的影响

【摘要】piggyBac转座子属于DNA型转座子,具有插入并且精确切离靶位点特性,是目前转基因研究中应用最广泛的工具之一,目前对于piggyBac类转座子的研究主要集中在不同生物体中新型转座子及其应用范围的探索,而对于转座子结构与活性关系的研究却较少。本文试图在不同细胞寄主与活体寄主中利用不同组合重组载体探索亚末端对piggyBac转座活性的影响,现将结果总结如下：1、以来自棉铃虫HnPLE和来自银纹夜蛾AaPLE的转座酶,构建了Helper辅助质粒,并利用二元转化系统,在果蝇S2细胞中检测了这两种转座酶对不同末端重复序列和亚末端重复序列组合的重组供体质粒的剪切活性。结果显示,AaPLE转座酶不具备活性,但HaPLE可以识别自身末端反向重复序列与赤拟谷盗亚末端反向重复序列组合的重组供体,这表明HaPLE转座酶具有明显的转座活性,它可以识别自身末端反向重复序列与适宜亚末端反向重复序列构建的供体质粒,但剪切的精确性可能受到亚末端的影响。2、通过不同亚末端替换构建供体,在果蝇S2细胞中检测了小地老虎AyPLE和棉蚜AgPLE的转座酶活性,结果发现AyPLE.AgPLE对所试供体质粒均有显著的剪切活性,不同亚末端对转座活性有一定影响,但统计差异不显著。这揭示了转座酶可能存在适应不同亚末端的自身调控机制。此外,也可能是由于所选亚末端种类较少,未能检测出亚末端的显著影响。3、利用Helper/Donor二元转化系统在仓鼠肾上皮细胞BHK中检测了来自粉纹夜蛾IFP2、小地老虎AyPLE和棉蚜AgPLE转座酶对不同亚末端供体的剪切活性。结果显示,在BHK细胞中AyPLE转座酶可以识别剪切来自小地老虎末端反向重复序列与红铃虫亚末端反向重复序列组合的重组供体Ay-Pg,AgPLE转座酶与来自棉蚜末端反向重复序列与赤拟谷盗亚末端反向重复序列组合的重组供体Ag-Tc,以及来自棉蚜末端反向重复序列与粉纹夜蛾亚末端反向重复序列组合的重组供体Ag-d共转染均能产生近似精确剪切条带。综合在果蝇S2细胞的分析结果表明,转座酶剪切精确性受寄主细胞和亚末端反向重复序列共同影响。4、利用Helper/Donor二元转化系统在和显微注射技术在不同昆虫中检测IFP2、AyPLE和AgPLE转座酶对不同亚末端重组供体剪切活性。结果显示：研究同纲同目不同种宿主亚末端是否会影响转座子对不同重组供体精确剪切活性。结果显示：IFP2转座子在实验所选取的这几类昆虫中都具有精确剪切活性,AyPLE.AgPLE转座子在不同昆虫都只能产生非精确剪切,这可能和AyPLE.AgPLE转座子没有属于自身或合适的亚末端有关,由此表明,当转座子缺失自身亚末端反向重复序列后,在活体中几乎不会表现出精确剪切。本文主要利用二元转化系统,比较不同亚末端对几种转座子在不同细胞和活体寄主中转座和剪切活性影响,进一步证实亚末端对转座酶活性稳定表达和精确性产生影响,这为基因改造转座子提供新思路,具有理论和实践价值。
【作者】骆晨；
【导师】韩召军；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】piggyBac转座子；二元转化系统；亚末端；转座活性；

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