三疣梭子蟹pentraxin样蛋白的克隆及生物学功能初步研究

【摘要】Pentraxin是动物进化过程中产生的一类高度保守的血浆免疫蛋白质超家族，分子特点是在其羧基端有段200个氨基酸残基的保守序列，包含pentraxin的标志性序列（HxCxS/TWxS，这里的x代表任意氨基酸残基）。基于亚基的主要结构的不同，将Pentraxin蛋白分为长型和短型2种不同的类型。CRP和SAP是典型的短型pentraxin，pentraxin3则是长型pentraxin的代表。Pentraxin家族成员在炎症发生和机体免疫反应过程中都发挥着重要作用。目前pentraxin家族的研究主要集中在脊椎动物领域，无脊椎动物只在鲎中发现了pentraxin家族的成员CRP，三疣梭子蟹中未见相关报导。在本研究中，我们首先从三疣梭子蟹中克隆pentraxin样基因，由于该基因变异较大，通过同源蛋白设计简并引物较困难，因此我们采用cDNA文库筛选法筛选所需基因，成功得到pentraxin样基因的全序列。其开放阅读框编码266个氨基酸残基，SignalP4.0Server在线分析显示N端25个氨基酸残基为信号肽，表明克隆的pentraxin样蛋白是一个分泌蛋白。运用实时荧光定量PCR进一步研究该基因的组织特异性分布(血细胞、肝胰脏、肌肉、眼、鳃、胃)以及副溶血弧菌诱导后血细胞中基因表达情况的变化。结果表明，pentraxin样基因在血细胞中表达量最高，菌体诱导后，基因表达趋势为先下降后上升，在48小时后恢复原水平，表明该基因和机体的免疫反应相关。运用基因工程手段，构建pentraxin样基因的原核表达载体pET-28a-rPentraxin，并转化大肠杆菌transtta（DE3）感受态菌株得到重组pentraxin蛋白的基因工程菌株。IPTG诱导后表达成功，分子条带大小符合重组蛋白的预期且表达量较高。确定重组蛋白表达后，采用镍柱纯化目的蛋白，得到重组蛋白粗品后再用肠激酶进行酶切，去除融合的标签，再次利用镍柱除去标签，得到pentraxin样蛋白的纯品，进行抑菌活性检测，结果表明pentraxin样蛋白对革兰氏阴性和阳性菌均有抑菌活性。综上所述，本研究克隆并鉴定了一个三疣梭子蟹pentraxin样基因的cDNA全序列，构建了该蛋白的原核表达载体并成功表达，检测到重组蛋白有抑菌活性。基因的荧光定量表达分析表明该基因致病菌诱导后表达量下降，在免疫反应中可能存在某种负调节作用，有待进一步探讨。
【作者】王京波；
【导师】申望；
【作者基本信息】浙江海洋学院，海洋生物学，2014，硕士
【关键词】三疣梭子蟹；pentraxin样基因；基因表达；抑菌活性；

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