甜菜夜蛾嗅觉受体和感觉神经元膜蛋白基因的克隆、表达定位及功能研究

【摘要】昆虫个体之间以及个体与环境之间的关系主要依靠化学通讯来调节,嗅觉是昆虫主要的行为反应模式,通过位于嗅觉组织表面的各类嗅觉感受器,昆虫能够感受到环境中大量的气味信息,产生相应的生理或行为反应,如寻找寄主植物、交配产卵、躲避危险等。昆虫特别是蛾类昆虫两性间的化学通讯具有高度的灵敏性和种特异性,根据这一特性设计的性引诱剂已经广泛应用于害虫的种群监测和害虫防治的实践中。目前发展的害虫引诱剂有诸多缺点,如结构不稳定、通常只能引诱雄虫等,这对于多次交配的鳞翅目害虫防治效果并不理想,主要原因是对害虫嗅觉识别的分子机理的研究不够深入。研究表明在昆虫外周感受器中有多种蛋白参与了嗅觉识别的过程,如气味结合蛋白(Odorantbindingproteins,OBPs)、气味降解酶(Odorantdegradingenzyme,ODEs).气味受体(Odorantreceptors,ORs；Ionotropicreceptors,IRs)、感觉神经元膜蛋白(Sensoryneuronmembraneproteins,SNMPs)等,在鳞翅目中对于气味结合蛋白的研究较多,而对于OR及SNMP的研究较少。OR位于感觉神经树突膜上,外界的气味信号在这里转化为电信号,而SNMP可能在外界气味分子顺利到达进而激活气味受体的过程中起重要作用。本研究针对我国重要农业害虫甜菜夜蛾Spodopteraexigua寻找寄主植物及雌雄个体间的交流的分子机理进行研究,克隆了甜菜夜蛾雄虫识别雌虫性信息素的性信息素受体基因(OR6,OR11,OR13,OR16),通过体外表达和电生理记录研究了这些受体的功能；克隆和鉴定了2个在甜菜夜蛾寻找寄主过程中起重要作用的气味受体基因(OR3,OR18):克隆了2个SNMP基因并对其进行了感器定位研究,探讨了SNMP在性信息素识别过程中的可能作用。主要结果如下：1甜菜夜蛾性信息素受体基因的鉴定、表达分析和功能研究通过同源克隆的方法在甜菜夜蛾触角中获得4个性信息素受体(PR)基因片段,进一步通过RACE技术获得全长,并登录到GenBank,基因名称(GenBank登录号)分别为SexiOR6(KC299916)、SexiOR11(KC299917)、SexiOR13(KC299918)和SexiOR16(KC299919)。进化树分析表明,这4个PR与已经报道的鳞翅目昆虫性信息素受体聚类到一个亚族。利用实时荧光定量PCR(qPCR)进行表达水平的测定,发现这4个PR都在触角中高表达,其中SexiOR6、SexiOR13和sexiOR16主要在雄虫触角中高表达,这与雄虫利用这些受体感受雌虫性信息素的功能相一致；SexiOR11在雌雄虫触角中均高表达；另外,4个基因在其它的嗅觉组织(如下唇须和喙)中也有微量表达。PR的这种表达模式与昆虫行为反应的关系有待进一步研究。进一步比较这4个PR在触角中的表达量发现,在雄虫触角中SexiOR6(?)勺表达量最高,约为其它3个PR的10倍左右,这与其它近缘种的几种性信息素受体的表达量差异不一致,可能缘于昆虫种间的差异。在非洲爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)分别对4个PR和Orco基因进行共表达,并用双电极电压钳记录系统测定PR/Orco对性信息素组分的反应,结果显示,SexiOR13和SexiOR16对甜菜夜蛾的性信息素都有反应。比较而言,SexiOR13对Z9,E12-14:OAc和Z9-14:OAc的反应最大,但对Z9,E12-14:OAc的灵敏度(EC50=3.158×10-6M)是Z9-14:OAc(EC50=1.203×10-5M)的4倍左右。而SexiOR16对Z9-14:OH的反应最大,灵敏度很高(EC50=9.690×10-7M)。研究结果为进一步明确性信息素感受的分子机制奠定了基础。2甜菜夜蛾普通气味受体基因的鉴定、定位和功能研究利用同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得2个普通气味受体基因片段,并通过RACE技术获得全长cDNA.2个基因名称(GenBank登录号)分别为SexiOR3(JF747606)和SexiOR18(JN873314).进化分析发现,这2个OR属于庞大的普通气味受体亚家族。qPCR测定发现,2个普通气味受体主要在触角中表达,但不同于性信息素受体的是,它们在雌虫触角中的表达量显著高于雄虫触角。利用原位杂交技术(insituhybridization)定位了这2个基因以及Orco基因在成虫触角中的表达,发现SexiOR3主要在短毛形感器下表达,长毛形感器下少量表达而在腔锥形感器和刺形感器下没有表达；SexiOR18主要在毛形感器(包括长毛形感器和短毛形感器)和锥形感器下表达,而在腔锥形感器和刺形感器下不表达；SexiOrco基因的表达比较广泛,在毛形感器、锥形感器、腔锥形感器下都有表达,但在栓锥形感器和刺形感器中没有表达。利用非洲爪蟾卵母细胞进行异源表达SexiOR3和SexiOR18,然后用双电极电压钳记录系统测定了3个OR对62种植物气味的反应。结果表明,SexiOR3仅对E-β-法尼烯、法尼醇、橙花叔醇、香叶醇和己酸壬酯有明显的反应,其中对E-β-法尼烯的反应最强,EC50=3.599×10-7M。进一步筛选发现苯乙醛能显著抑制SexiOR3对E-β-法尼烯的反应,且在高浓度时抑制作用更强,而对其它几种能引起SexiOR3反应的化合物没有抑制作用,推测苯乙醛是SexiOR3识别E-β-法尼烯的抑制剂。SexiOR18对所测定的普通气味均无反应,其功能有待于进一步研究。3甜菜夜蛾感觉神经元膜蛋白基因的克隆、序列分析和表达水平研究利用同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得2个感觉神经元膜蛋白基因的开放阅读框全长,基因名称(GenBank登录号)分别为SexiSNMP1(JX469106)和SexiSNMP2(JX469107).将2个SNMP进行进化树分析发现,两者分别属于SNMP1和SNMP2亚组,两者间的氨基酸相似度仅29%。qPCR测定发现,SexiSNMP1在成虫触角中特异性表达；SexiSNMP2除在成虫触角中高表达外,在喙和下唇须等组织中也有少量表达。2个SexiSNMP相比较,在雄虫触角中SexiSNMP2的表达量显著高于SexiSNMP1,而在雌虫触角中两者没有差异。利用原位杂交技术定位了这2个基因在雌雄触角中的感器分布,结果显示,SexiSNMP1和SexiSNMP2在毛形感器和锥形感器下都有表达,暗示这2个基因不仅参与感受性信息素而且还参与普通气味的识别。综上所述,本文首次从甜菜夜蛾的触角中克隆了6个气味受体基因和2个感觉神经元膜蛋白基因,测定了这些基因的表达特征,并初步研究了这些基因在性信息素组分及62种普通气味感受中的功能。研究结果为明确甜菜夜蛾的气味感受机制,以及开发新型、高效的害虫行为调控技术提供了重要依据。
【作者】刘程程；
【导师】董双林；王桂荣；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】甜菜夜蛾；性信息素受体；普通气味受体；感觉神经元膜蛋白；

【参考文献】
[1]汪方中.地区电网变压器经济运行工程化研究[D].河海大学,电力系统及其自动化,2003,硕士.
[2]梁程广.华龙证券公司网络营销探析[D].兰州大学,金融,2014,硕士.
[3]孔二虎.基于遗传算法的控制系统仿真研究[D].辽宁工程技术大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[4]喻琴瑶.老年人犯罪刑事立法完善研究[D].贵州民族大学,法学,2014,硕士.
[5]陈静.改变与认同： 瑞华浸信会与山东地方社会[D].山东大学,中国近现代史,2013,硕士.
[6]乔燕燕.工程地质遥感解译辅助教学及考试系统的设计与实现[D].西南交通大学,摄影测量与遥感,2013,硕士.
[7]田丽娜.苹果分级检测算法的研究[D].陕西科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[8]钢苏和.Autotaxin在人胃癌中表达的研究[D].内蒙古大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[9]董忠谊.双泛素蛋白FAT10在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制的初步探讨[D].南方医科大学,肿瘤放射治疗学,2012,硕士.
[10]荆玉杰.法藏敦煌诗文选集叙录[D].兰州大学,历史文献学,2013,硕士.
[11]沈慧.石墨烯产业曙光初现专利布局成焦点[J].化工管理,2015,01:42-43.
[12]李光磊.控制性详细规划与城市设计的互补与融合[D].山东大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[13]丑国珍.城市空间的层次及尺度空间初探[D].重庆大学,建筑设计及其理论,2003,硕士.
[14]田如.世界穆斯林旅行商大会口译实践报告—主体性意识视角下陪同口译员的素养要求[D].宁夏大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[15]陈辉,陈丹,谢伟淼,郑翔,李国华.核壳结构碳化钨/碳化钨铁复合材料的制备与电催化活性[J].物理化学学报,2014,05:891-898.
[16]孙春龙.水稻抗性淀粉含量性状的QTL定位及遗传分析[D].吉林大学,作物栽培学与耕作学,2013,硕士.
[17]林琳.基于压缩感知的信号重构与分类算法研究[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[18]王蓉.巴彦淖尔市政府部门信息资源共享研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[19]范彩霞.人工神经网络辅助HPMC缓释片处方设计[D].浙江大学,2004.
[20]肖劲松,林子禹,毛超.关联规则在零售商业的应用[J].计算机工程,2004,03:189-190+195.
[21]张志伟.从语义地图角度看几种语言部分亲属称谓语[J].现代语文(语言研究版),2014,07:133-138.
[22]张维.水下变结构金刚石绳锯机的研制[D].哈尔滨工程大学,机械电子工程,2012,硕士.
[23]廖海军.有机硅聚合物—聚丙烯酸酯梯度材料制备研究[D].武汉理工大学,材料学,2004,硕士.
[24]任德龙.多组分耦合反应模型在含铌铁水渣金反应中的应用研究[D].内蒙古科技大学,钢铁冶金,2014,硕士.
[25]陈海庆,赵峰,金莉,方新城.时态数据的一种挖掘算法[J].计算机与数字工程,2003,02:15-17.
[26]魏婕.硼化物小分子MB_2、M_2B(M=Na,B)基态势能函数[D].新疆师范大学,理论物理,2013,硕士.
[27]朱光.三扬独立热电联产能源系统项目风险控制研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[28]李永东.农安县耕地质量监测研究[D].吉林大学,地质工程,2014,硕士.
[29]胡锦.四川郫县农村集体土地流转问题研究[D].西南交通大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[30]傅诒辉.关于文“LQ逆问题研究”的问题讨论[J].自动化学报,1995,03:383-384.
[31]陈万.模板化航空静止变流器逆变环节研究[D].南京航空航天大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[32]陈晴钰.荣格分析心理学的女性主义解读[D].南京师范大学,女性教育学,2012,硕士.
[33]牛波.多元智能理论在中学生物教学中的应用[D].华东师范大学,教育,2003,硕士.
[34]陈力.双层博弈视角下台湾当局开放陆资入岛政策评析[D].上海国际问题研究院,国际政治,2013,硕士.
[35]赵书.心理控制源、组织嵌入和非工作上网行为的关系研究[D].西南大学,应用心理学,2013,硕士.
[36]王青玲.一株乙羧氟草醚高效降解菌的分离鉴定、降解特性及其应用研究[D].南京农业大学,环境科学,2012,硕士.
[37]李振环.海面大型舰船目标红外成像研究[D].哈尔滨工业大学,工程热物理,2014,硕士.
[38]曹建国.球状Co_3O_(4-)低维碳复合材料的制备及其锂离子电池负极性能研究[D].湖南大学,2013.
[39]徐华林.无线电频率干扰与频率管理[J].通讯产品世界.1996(09)
[40]滕新蔚.梅钢180m~2烧结机烟气脱硫系统控制[J].冶金自动化,2010,04:27-31.
[41]柴琳琳.重金属Ni、Co在紫花苜蓿和新疆某地土壤中的积累特征研究[D].新疆大学,分析化学,2013,硕士.
[42]公宁.完善自主创新产品政府采购政策研究[D].华南理工大学,行政管理,2014,硕士.
[43]陈威.芳纶平纹织物的表面改性及其防刺特征研究[D].北京理工大学,2014.
[44]邹晓鸥.中国IT企业战略转型探析[D].首都经济贸易大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[45]袁雪锋.邮政普遍服务补偿机制的行政法研究[D].中国政法大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[46]王雀.建筑中的留白—浅析建筑留白与环境的共生[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[47]马明智.组合型静止无功补偿装置的研究与设计[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[48]刘晓芬.“隔”字句的共时特征和历时变化研究[D].华中师范大学,汉语言文字,2014,硕士.
[49]郭军.煤田火区高温贫氧氧化燃烧特性参数研究[D].西安科技大学,安全技术及工程,2014,硕士.
[50]夏飞.试样整经机的若干关键技术的研究[D].东华大学,纺织工程,2004,硕士.