大豆疫霉无毒基因Avr3a识别位点及亚细胞定位分析

【摘要】大豆根腐病严重威胁世界范围内的大豆生产,每年在农业生产上都会造成上高达二十亿美元的损失,而引起这种病害的病原菌就是大豆疫霉。大豆疫霉与真菌亲缘关系较远,传统防治真菌的药物对其效果不明显,控制大豆疫霉根腐病的主要措施是培育抗病品种。无毒基因与抗病基因的互相识别会直接影响大豆疫霉致病性和大豆的抗病性。目前已有多种抗病基因和无毒基因被鉴定克隆。在大豆疫霉与大豆之间协同进化过程中,大豆疫霉会通过自身不断变异来逃避抗病基因的识别,无毒基因在自然界中的多态性就是它逃避识别的一种手段。研究无毒基因的多态性,寻找关键识别区域和位点对了解大豆疫霉致病机制,有效控制大豆根腐病具有重要意义。PsAvr3a是已经被克隆的大豆疫霉的无毒基因,Avr3a在不同菌株P6497、P7064、ACR12、HN25、HN35中存在多态性,但在P7064中不转录。基于已有的研究结果,通过基因枪瞬时表达首先确认Avr3a中20个氨基酸左右的信号肽(signalpeptide,SP)对Avr3a-Rps3a的识别没有影响。将P6497、ACR12、HN25、HN35中缺失信号肽的Avr3a-SP在含有Rps3a的大豆叶片上瞬时表达,无毒菌株P6497、ACR12中的Avr3a能够被Rps3a所识别,引起细胞坏死,而毒性菌株HN25、HN35中的Avr3a中不能被识别,这表明Avr3a-Rps3a的识别直接决定了Avr3a的无毒功能。其氨基酸突变位点主要集中在C端W-motif附近区域,生物信息学预测77位和82位氨基酸有可能是识别的关键位点。因此将一系列Avr3a的缺失突变体在含有Rps3a的大豆叶片上瞬时表达,发现识别关键区域在第61位到第112位氨基酸的区域,Wmotif及其前后的区域对识别都很重要。分别将Avr3aP649777位的天冬氨酸(D)点突变为甘氨酸(G),82位组氨酸(H)点突变为天冬氨酸(D),突变体仍被Rps3a识别,而同时突变77位的天冬氨酸(D)为甘氨酸(G),82位组氨酸(H)为天冬氨酸(D),对Avr3a与Rps3a的识别有一定影响。对Avr3a的亚细胞定位研究发现,Avr3aP6497、亚细胞定位在细胞核、细胞质中。将Avr3aP6497的C端分别与核定位信号(NLS1和NLS2)和核输出信号(NES)融合,发现NLS2、NES都改变了Avr3aP6497的定位而NLS1没有改变Avr3ap6497的定位；将Avr3aHN25的C端核定位信号(NLS2)和核输出信号(NES)融合,发现NLS2、NES也改变了Avr3aHN25的定位。改变Avr3ap6497的定位,影响了Avr3aP6497被Rps3a识别。但改变Avr3aHN25的定位,AvrSaHN25仍不能被Rps3a识别。推测Avr3a-Rps3a识别有可能发生在细胞质中。
【作者】翟路翀；
【导师】王源超；
【作者基本信息】南京农业大学，植物病理学，2013，硕士
【关键词】大豆疫霉；Avr3a；多态性；亚细胞定位；

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