雷帕霉素对脓毒症大鼠肝脏损害的保护作用及其机制

【摘要】目的：氧化应激是脓毒症诱发肝脏损害的关键因素。近来研究发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）在氧化应激过程中起着关键的调节作用。本文观察mTOR抑制剂雷帕霉素对脓毒症大鼠肝损害的保护作用，并对其机制进行初步探讨。方法：60只Wistar雄性大鼠随机分成三组：假手术组（10只）、脓毒症组（10只）、脓毒症+雷帕霉素组（20只）和脓毒症+PBS组（20只）。采用盲肠结扎穿刺法（cecalligationandpuncture,CLP）制作脓毒症模型。在实验前2h进行雷帕霉素（1mg/kg/d）灌胃处理，对照组采用同等剂量的PBS处理。大鼠眼眶取血，采用终点法检测不同时间点（3、6、12、24h）血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平；双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清氧化应激标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG)的水平；提取肝脏组织制备10%的匀浆液，离心后取上清液检测8-OhdG；并检测肝脏组织超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性和丙二醛（malonaldehyde,MDA）含量，采用实时定量PCR（Real-TimePCR）检测mTOR的表达；蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测mTOR、核糖体S6蛋白激酶（S6kinase,S6K）、磷酸化核糖体S6蛋白激酶（p-S6K）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的含量。不同浓度雷帕霉素（0、10、20、40μM）预处理HepG2细胞4h后，用200μM过氧化氢（H2O2）处理细胞3h。DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧，ELISA法检测MDA和SOD含量，Western-blot法检测p-S6K和p-AKT的水平。结果：相对于假手术组，CLP法处理动物后，血清ALT、AST、和8-OHdG的水平明显增高，肝脏组织SOD、GSH-Px和CAT活性降低，而8-OHdG水平和MDA活性明显升高；Real-TimePCR和/或Western-blot结果显示，CLP术后大鼠肝脏组织mTOR的表达明显升高，p-S6K和p-AKT水平增加，而S6K和AKT的表达不变。采用雷帕霉素处理显著降低CLP术后血清ALT、AST和8-OHdG的水平；并显著升高肝脏组织SOD、GSH-Px和CAT活性，降低MDA、p-S6K和p-AKT水平。不同浓度雷帕霉素预处理HepG2细胞后，降低H2O2诱导的细胞内活性氧生成，并降低MDA含量和上调SOD水平；Western-blot结果显示，雷帕霉素降低p-S6K和p-AKT的水平。结论：雷帕霉素通过抑制mTOR/S6K/AKT信号途径，降低脓毒症大鼠肝脏氧化应激水平，从而发挥其肝脏损伤的保护作用。
【作者】尹建亚；
【导师】卿国忠；
【作者基本信息】南华大学，内科学，2012，硕士
【关键词】雷帕霉素；脓毒症；肝损害；氧化应激；过氧化氢；

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