硫酸软骨素降解产物及其结构的液质联用分析方法研究

【摘要】本文首先以猪的硫酸软骨素(CS)作为样本,建立了CS完全酶解和部分酶解产物及其结构的高效液相色谱-光电二极管阵列检测器(HPLC-PDA)和高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析鉴定方法,并对酶解前处理及液质条件进行了优化；随后用三种不同的质谱方法对猪CS的部分酶解产物进行了分析鉴定并对三种方法的优缺点进行了比较；其次用已建立的液质方法对实验室自制的三文鱼和黑鱼CS的酶解产物进行了分析鉴定,并与猪CS的寡糖结构做了比较；最后用化学降解法对透明质酸(HA)和CS进行化学降解,然后用已建立的液质联用法对其降解产物的结构进行分析鉴定,并且对CS酶解和化学降解产物中寡糖的序列信息进行了比较。具体的研究内容与结论如下：首先,本文建立了对猪CS完全酶解产物分析鉴定的HPLC-PDA及HPLC-MS(4000QTrap)联用方法,并对酶解和液质联用条件进行了优化,结果表明完全酶解的最佳条件为：底物浓度：2mg/mL;酶液浓度：320mIU/mL;酶解反应时间：24h；反应缓冲液：50mM磷酸盐缓冲体系,pH=7.0。LC-MS分析鉴定结果表明,猪CS经硫酸软骨素ABC酶完全酶解后可以得到四种不饱和二糖,且每个种类的二糖所占二糖总量的比例分别为(不含S03的不饱和二糖)△Di-OS(30.1%)、(GalNAc的6号位碳带一个SO3的不饱和二糖)ADi-6S(18.5%)、ADi-4S(44.9%)、(GlcA的2号位碳和GalNAc的4号位碳上各含有一个SO3的不饱和二糖)△Di-diSB(6.5%),从此比例可看出样品猪的CS主要是由CS-A(硫酸软骨素A)和CS-C的混合物组成,且CS-A的含量要高于CS-C的量。其次,建立了高效液相色谱-电喷雾离子化-串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)对猪CS部分酶解产物的分析鉴定,并对色谱柱的选择、流动相的组成、离子源参数、质量分析器参数等进行了优化,结果表明采用XAmide色谱柱,ACN和10mMNH4Ac水溶液为流动相进行LC-ESI-MS/MS分析,可将CS部分酶解后的产物结构鉴定到聚合度为12(dp12)的寡糖片段,且各聚合度不等的寡糖片段在液质图上基本能分开；经过对各寡糖片段的一级及二级质谱图图谱解析,初步得出部分寡糖片段的结构为dp2：GlcAS1-GalNAcS1;dp4:dGlcAS1-GalNAcS1-GlcAS1-GalNAcS1;dp6:dGlcAS1-GalNAcS1-GlcAS1-GalNAcS1-GlcA-GalNAcS1;dp8:dGlcAS1-GalNAcS1-GlcAS1-GalNAcS1-GlcA-GalNAcS1-GlcA-GalNAcS1;dp10:dGlcA-GalNAc-(GlcA-GalNAc)4。接着,通过对电喷雾离子化-4000Q离子肼串联质谱(ESI-4000Q-Trap-MS/MS)、电喷雾离子化-傅立叶变换串联质谱(ESI-FT-MS/MS)和基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱(MALDI-TOF-MS)三种质谱方法对猪CS部分酶解产物的分析鉴定结果比较得出,FT-MS/MS能够把CS酶解后所得寡糖的序列信息详细地呈现出来,一级及二级质谱图中碎片信息极其丰富,可以将酶解产物鉴定到聚合度为24的寡糖序列,很适合糖胺聚糖(GAGs)类物质的结构分析,但由于其仪器价格昂贵,维护费用极高等缺点使其应用在国内外均受到限制。利用MALDI-TOF-MS分析GAGs类物质时,样品不需要复杂的前处理,耐盐能力强,质谱图中只有单电荷的碎片离子出现,为图谱解析带来了方便,但由于其基质干扰现象比较严重,且不能在线分析,也限制了其应用空间；本研究中MALDI-MS可以将CS的酶解产物鉴定到12糖,每个寡糖片段的质谱图中都会出现大量钠的加合物；小分子量的寡糖如dp4和dp6等的碎片信息比较丰富,且离子强度较高,但分子量较大的寡糖如dp10、dp12等,其质谱图受到的基质干扰现象严重,不利于寡糖序列的鉴定。4000QTrap-MS/MS用于分析GAGs时,也可以得到大量的碎片信息,且碎片中还会出现一些钠的加合物等,增加了碎片的有效信息量；虽然4000QTrap的分辨率、质量分析器等没有FTMS好,但该质谱仪价格较便宜、操作简便,基本能满足对一般寡糖的分析要求,且在国内外应用均比较普及。其后,用已建立的HPLC-ESI-MS/MS方法(4000QTrap)对实验室自制的三文鱼和黑鱼中CS酶解产物进行了分析鉴定并与猪CS的结构进行了比较,并对酶解产物中具有相同聚合度但含不同个数硫酸根基团(SO3)的寡糖片段做了相对定量。结果显示本研究中建立的液质方法可以很好的应用于鱼CS的寡糖序列分析及结构组成特点的研究,三文鱼和黑鱼的CS酶解产物可以分别鉴定到寡糖dp16和dp14；通过对三种来源CS酶解产物的结构组成比较发现：1、三种CS酶解后得到的具有相同dp的寡糖所对应的质谱图中碎片结构极其类似,除了个别碎片不同；2、三文鱼CS寡糖中S03的含量相对较多,且三种CS中S03含量的顺序为：三文鱼>猪>黑鱼。最后,用化学降解法(羟基自由基氧化降解)对HA和CS的降解产物进行分析。液质联用(4000QTRAP-MS)分析结果表明：HA经自由基氧解后可以得至dp3、dp4、dp5、dp7、dp8、dp9、dp10、dp12、dp13、dp15、dp16、dp19、dp20和dp21一系列聚合度不等的寡糖；CS经氧化降解后可以得至dp2、dp3、dp4、dp6、dp7、dp8、dp9、dp10和dp12一系列聚合度不等的寡糖,且产物中既有偶数寡糖又有基数寡糖。通过对酶解与自由基氧解猪CS所得产物碎片结构的比较发现,酶解产物中均是偶数寡糖,而氧解后的产物中既有偶数寡糖又有基数寡糖；CS酶解后所得寡糖多以不饱和形式出现,而氧解后的产物多以饱和寡糖的形式出现；酶解后产物的总离子流图(TIC)中色谱峰的分离程度要比氧解好得多,且图谱比较干净,杂质干扰少,寡糖碎片的结构比较有规律,而氧解后所得产物较复杂,质谱图中碎片有效信息量较少,给图谱解析带来一定困难。
【作者】林娜；
【导师】张虹；
【作者基本信息】浙江工商大学，食品工程（专业学位），2013，硕士
【关键词】液质联用分析方法；硫酸软骨素；糖胺聚糖；酶法降解；自由基氧化降解；

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