甲型流感病毒核蛋白保守性B细胞表位的鉴定研究

【摘要】甲型流感病毒(InfluenzaAviruses)属于正粘病毒科,其基因组是由8个分节段的单股负义RNA链组成的。历史上暴发过多次甲型流感病毒引起的全球流感大流行,造成大规模人群感染死亡：每年呈季节性流行的H1N1和H3N2甲型流感病毒可造成全球25-50万人感染死亡；近年来不断涌现的各种人感染禽流感病毒死亡事件也均是由甲型流感病毒引发的,因此,系统研究甲型流感病毒有助于加强人类对该病毒防控能力。甲型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)高度保守,是流感病毒诊断与分型的重要靶标；近年来研究发现NP在病毒的复制和增殖过程中起重要作用,使NP逐渐成为一个重要的抗流感病毒治疗靶标,因此,研究甲型流感NP蛋白对该病毒的诊断和抗病毒治疗均具有重要意义。表位研究对于病毒的诊断和抗病毒治疗均具有重要指导意义,但迄今NP中的B细胞表位仍罕见报道,可能与NP作为一个多聚体蛋白而构象复杂有关。本课题组前期在开发甲型流感病毒诊断试剂中曾积累了一批NP特异性单抗,本研究拟在此基础上,进一步对这些NP单抗进行表位鉴定,发现潜在的保守性B细胞表位,并研究表位的相关功能,以期对流感病毒的预防和治疗提供科学依据。本研究取得以下研究结果：第一,用禽源和人源NP蛋白把NP单抗分成三类。首先,选取禽源流感病毒分支上的代表株A/HK/212/03(H5N1,HK/212)及人源流感病毒分支上的代表株A/California/04/2009(H1N1,CA/04)的NP基因,用大肠杆菌重组表达rNP-HK/212和rNP-CA/04;其次分别检测了NP单抗盘对禽源rNP-HK/212及人源rNP-CA/04两种重组NP蛋白的反应性,根据单抗同两类NP抗原的反应性可将单抗库分成三类(ClassA,ClassB和ClassC),其中ClassA类单抗对两种NP重组蛋白均有很好的反应性,ClassB类单抗对禽源rNP-HK/212有很好的反应性,但对人源rNP-CA/04不反应；ClassC类单抗对人源rNP-CA/04有很好的反应性,对禽源rNP-HK/212的反应性明显减弱,说明ClassA类单抗是广谱单抗,ClassB类单抗能特异性识别禽宿主流感病毒。第二,用重组NP片段把广谱NP单抗(ClassA类)分成三类。首先,用大肠杆菌重组表达rNP-HK/212三个rNP分段基因亚克隆重组抗原,然后用F1(1-120aa)、F2(110-301aa)、F3(293-498aa)及全长rNP这四种抗原对ClassA类广谱单抗进行Westernbloting分析,根据反应性强弱,把单抗分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类单抗,其中Ⅰ类单抗对全长rNP和F2片段有反应,Ⅱ类单抗对全长rNP有反应,对F1、F2、F3片段无反应,第Ⅲ类单抗则对四种重组抗原均无反应,说明Ⅰ类单抗可能识别NP的线性表位,Ⅱ、Ⅲ类单抗主要识别NP的构象表位。第三,Ⅰ类线性NP单抗的发现及表位鉴定。上述研究发现Ⅰ类单抗对全长rNP及F2片段有Westernbloting反应,以4D2作为单抗代表运用Westernbloting,Immunofluorescence,Co-Immunoprecipitation,Immunohistochemistry方法验证了Ⅰ类单抗对天然病毒有良好的反应性,并最终证明Ⅰ类单抗识别NP的保守线性表位”RESRNPGNA”,介于NP的第243-251氨基酸之间,是迄今为止第一个NP线性B细胞表位。该线性表位和线性单抗的发现,有望发展成为一个有用的蛋白表达与纯化的标签。第四,Ⅱ类广谱构象性单抗的识别表位关键氨基酸鉴定,并探索其潜在功能。上述研究中Ⅱ类单抗对全长rNP有Westernbloting反应,对F1、F2、F3片段无反应,提示Ⅱ类单抗可能识别的是NP的构象表位,首先调取Ⅱ类单抗代表株19C10的可变区基因,运用分子对接分析方法得到7个预测氨基酸,其次结合点突变最终确定D88为构象表位的关键位点,进而结合冷冻电镜对NP单体的原子结构进行预测,证明NP的D88是影响NP同PB2结合的关键位点,同时也影响RNP的合成。第五,鉴定禽宿主特异性的ClassB类单抗的识别表位,并建立一种适合禽流感特异性检测的诊断方法。首先利用氨基酸比对及分子模拟预测关键位点,其次利用点突变进行验证,成功发现人禽流感病毒NP第100位氨基酸为造成宿主差异性的关键位点,并开发为特异性识别禽流感NP的诊断试剂盒。总之,本研究发现了一个NP的B细胞保守线性表位243RESRNPGNA251,同时发现一个NP构象B细胞表位的关键氨基酸D88,并证明该位点能影响NP同PB2的结合进而影响RNP的合成及病毒的复制功能,同时发现了人禽宿主差异的流感病毒NP保守性表位并成功开发了特异性识别禽流感的诊断试剂,对流感病毒的预防和治疗提供科学依据,对流感病毒的诊断和抗病毒治疗有重要意义。
【作者】张旭辉；
【导师】夏宁邵；
【作者基本信息】厦门大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】甲型流感病毒；NP；单克隆抗体；表位；鉴定；

【参考文献】
[1]侯晓文.从使用与满足理论探析传统杂志与微博的跨媒体合作[D].山东师范大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[2]武德峰,李国辉,来旭,胡军涛.多媒体数据集中的数据挖掘:系统框架和方法[J].计算机应用研究,2005,02:53-56.
[3]王璐.神经心理学视角下的口译工作记忆的实证研究[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[4]林晨露.中学地理审美教学体系的构建及实施[D].湖南师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[5]董美伶.柔性索杆支承体系点支式玻璃幕墙的风振响应分析[D].山东建筑大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[6]王双双.大众文化语境下中国文艺媒体批评研究[D].山东师范大学,文艺学,2013,硕士.
[7]沈叶.乳腺癌组织中微血管密度、癌组织及血清中VEGF、bFGF之间的相关性研究[D].苏州大学,病理学与病理生理学,2014,硕士.
[8]沈珺.PA保险公司组织结构优化研究[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[9]杜学诗.高等教育对区域经济增长贡献的分析研究[D].安徽农业大学,产业经济学,2012,硕士.
[10]赵远强.列车节能运行算法研究[D].西南交通大学,车辆工程,2013,硕士.
[11]颜君彪,荣秋生.基于CMAR分类算法的实现[J].湖南文理学院学报(自然科学版),2005,03:60-62+82.
[12]龙永福.稻草机械浆浸渍工艺研究及设备设计[D].南京林业大学,制浆造纸工程,2004,硕士.
[13]肖竣文.迁安常州沟组底砾岩特征及成因分析[D].中国地质大学（北京）,古生物学与地层学,2014,硕士.
[14]沈玫.采前草酸、钙结合萘乙酸处理对猕猴桃果实贮藏性的影响[D].浙江工商大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[15]吴可.土家族服饰独有视觉符号价值初探[D].武汉纺织大学,设计艺术学,2013,硕士.
[16]康雅婷.新島襄の教育理念とその実践活動に関する考察[D].西安外国语大学,日语语言文学,2014,硕士.
[17]王琦.沈阳市市内主要城区商业性健身俱乐部发展现状及对策研究[D].辽宁师范大学,体育教育训练学,2011,硕士.
[18]荣义仿.经济要素流动对东亚地区秩序的影响研究[D].苏州大学,国际关系,2014,硕士.
[19]康晋容.兰德融资担保公司营销渠道管理体系研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[20]欧阳秋.我国货币政策行业效应的异质性[D].南京财经大学,金融学,2013,硕士.
[21]袁国军.别嘌呤醇对尿酸诱导的平滑肌细胞赖氨酰氧化酶表达的影响[D].遵义医学院,内科学,2013,硕士.
[22]米志刚.关于数列空间e~p的左右极限空间e~(p-0)与e~(p+0)[D].内蒙古大学,数学,2013,硕士.
[23]刘汉琴.美术院校教师信息查寻行为研究[D].西南大学,图书馆学,2014,硕士.
[24]贾建洪,俞冬萍,许萌,高建荣,梁作强,单淑婷,屠宇侠,陈静静.超细分散蓝291的制备[J].浙江工业大学学报,2012,05:477-480.
[25]姜英.癸氧喹酯固体分散剂的制备及其抗兔球虫效果的研究[D].河南科技大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[26]于素丽.员利针疗法合用独活寄生汤加减方治疗产后身痛的临床疗效观察[D].北京中医药大学,中医临床,2013,硕士.
[27]徐彬.烟台市滨海平原全新世沉积物粒度特征及沉积环境分析[D].鲁东大学,自然地理学,2014,硕士.
[28]王凤先.硫化钼与氧化铜纳米材料的合成及电化学性质[D].浙江师范大学,2013.
[29]张开来.民营施工企业核心竞争力研究[D].湖南农业大学,2005.
[30]邵敏娇.支付方式、消费动机对消费额度的影响[D].苏州大学,应用心理学（专业学位）,2014,硕士.
[31]韩丙锐.影视表演中表情语言的研究[D].安徽大学,戏剧,2014,硕士.
[32]秦君.中国古代儒家法中的民本思想研究[D].新疆大学,法律,2013,硕士.
[33]杨宇.经皮冠状动脉介入治疗术对稳定性心绞痛患者冠状动脉微循环影响的研究[D].南方医科大学,内科学（专业学位）,2014,博士.
[34]马景园.论少数民族文化对黑社会性质犯罪的防控作用[D].西南大学,民商法,2014,硕士.
[35]黄骋龙.试论徐渭的书画艺术[D].曲阜师范大学,美术学,2013,硕士.
[36]黄琪.二乙基三胺五乙酸促进Fe@Fe_2O_3纳米线活化分子氧降解典型有机污染物的研究[D].华中师范大学,物理化学,2014,硕士.
[37]熊智华,王雄,徐用懋.一种利用多神经网络结构建立非线性软测量模型的方法[J].控制与决策,2000,02:173-176.
[38]李辰.交通方式划分的LOGIT模型方法[D].河海大学,2004.
[39]刘湃.海岸线港口化过程研究[D].大连海事大学,交通运输工程,2013,硕士.
[40]陈辉.酒店员工满意度提升对策研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[41]李忠良.ZX公司的大客户管理策略分析与研究[D].重庆大学,工商管理,2003,硕士.
[42]孙丽霞.圆形微管道内的Maxwell流体的周期电渗流动[D].内蒙古大学,数学,2013,硕士.
[43]梁悌尹.长春市公共租赁住房制度研究[D].吉林大学,公共治理与公共政策,2013,硕士.
[44]祁康峰.基于Java的个性化推荐系统研究[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[45]苑琳.碱性蛋白酶的发酵与酶学性质的研究[D].天津科技大学,发酵工程,2004,硕士.
[46]张超.基于嵌入式Linux的交通视频采集传输系统[D].长安大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[47]姚伟.电动汽车车载数字直流变换器的研究[D].南京航空航天大学,电路与系统,2012,硕士.
[48]蓝云春.《德伯家的苔丝》中的现代主义主题[D].江西师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[49]王索因.曲江旅游景区游客现场管理与创意提升策略研究[D].西安外国语大学,旅游管理（专业学位）,2013,硕士.
[50]周璟.外源水溶性有机物在土壤中的动态及其对重金属环境行为的影响[D].扬州大学,环境科学,2012,硕士.