鲨鱼再生肝脏中TBC1D15基因的表达和蛋白结晶条件的筛选

【摘要】鲨肝活性肽（activepeptidefromsharkliver，APSL）是从条纹斑竹鲨的肝脏中分离纯化到的一种肝细胞刺激因子（HepaticStimulatorSubstance，HSS），对糖尿病有潜在的治疗作用。研究表明APSL对糖尿病小鼠具有保肝护胰岛并改善其并发症的作用。这为将其开发为新型抗2型糖尿病药物提供了实验依据。但是其作用机制以及发挥作用的靶点仍属未知，这对新型药物的开发带来难度。通过结构生物学解析APSL的三维结构，有助于理解其作用机制，找到发挥作用的靶点。本实验成功纯化获得了APSL和融合蛋白MBP-APSL，晶体形成条件筛选实验显示目的蛋白均发生沉淀未获得晶体，结合二级结构预测，我们推测APSL蛋白不是完整蛋白。因此，需要找到APSL的全基因序列。通过建立鲨鱼1/3肝脏切除再生模型，构建鲨鱼再生肝脏cDNA文库，以APSL基因为模板筛选得到一个长度为2133bp的ORF框。生物信息学分析发现其具有TBC1D15蛋白家族成员的特征序列结构，推测其为鲨鱼肝脏中的TBC1D15基因，APSL蛋白位于TBC1D15蛋白N端的未知功能的结构域DUF3548内。通过大肠杆菌表达系统和昆虫细胞表达系统成功获得鲨鱼TBC1D15蛋白及其他物种的同源TBC1D15蛋白并开展了重组蛋白结晶条件筛选。目前蛋白晶体条件筛选仍在进行中。为了进一步确定纯化所得的蛋白为TBC1D15蛋白，进行Rab-GAP活性实验。由于TBC1D15蛋白能特异性识别Rab7a蛋白，所以以野生型Rab7a-wt基因为模板，通过OverlapPCR技术，获得激活型Rab7a-Q67L和抑制型Rab7a-T22N基因并原核表达纯化获得融合蛋白Biotin-MBP-Rab7a-wt/Q67L/T22N。AlphaScreen实验检测TBC1D15蛋白与Rab7a蛋白的相互作用。结果显示该TBC1D15蛋白具有Rab-GAP活性。目前仍未有TBC1D15蛋白晶体及结构的报导。本研究首次发现鲨鱼再生肝中的TBC1D15蛋白并提供了一种纯化及活性检测的方法，对后续的TBC1D15蛋白的结晶及结构解析具有一定的指导意义。
【作者】王涛；
【导师】吕正兵；徐华强；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】APSL；TBC1D15蛋白；Rab-GAP活性；Rab7a蛋白；

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