亚麻籽木酚素不同水解产物结构鉴定及活性研究

【摘要】亚麻籽又称胡麻,作为一种重要的油料作物广泛分布于中国华北、东北、西北高寒地区。因其含有大量的脂肪酸、亚麻酸、植物胶、蛋白质、食用纤维及维生素等,故在心血管疾病的防治、降低血液胆固醇、减少糖尿病、提高人体抗氧化水平减少结肠癌形成、防止肿瘤等方面起到重要的作用。亚麻木酚素是亚麻籽水解产物化学成分之一,是一种植物雌激素的生物活性物质,其在亚麻籽中含量非常丰富。其活性表现在抗癌、抗真菌、预防糖尿病、抑制DNA和RNA合成作用、降低体内脂质过氧化水平、抗心血管疾病、抗病毒,因此广受专家学者的关注。本研究以亚麻籽为研究对象,通过60%乙醇提取亚麻籽中木酚素大分子化合物并采用碱解和木质素降解酶解两种不同水解方法对其大分子进行水解,建立反相液相色谱-紫外检测法(RP-HPLC/UV)和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS/MS)两种分析方法对亚麻籽木酚素大分子水解产物进行分离定量以及定性分析;比较了亚麻籽木酚素大分子化合物经碱水解和酶水解后所得水解产物个数,相同水解产物得率以及水解方法难易的差异性,选择出较优的水解方法并将其水解产物运用于活性评价中；建立了一种新的梯度半制备液相色谱方法分离和收集不同木酚素水解产物馏分。将HPLC/MS/MS鉴定出的4种不同馏分运用于抑菌活性,抗氧化活性以及抗癌活性评价中,为亚麻籽木酚素的利用和开发提供了参考。本文第一部分,首先以SDG标准品建立水解产物定量方法,求得标准曲线为y=3000000x-9174.33,据此分析比较60%乙醇和2MNaOH先后反应或者醇碱同时反应(63%乙醇：2MNaOH=7:3)提取水解亚麻籽木酚素,结果表明产物SDG的产率分别为7.69mg/g,4.56mg/g,因此选择先醇提后碱解的水解方法；其次通过比较不同碱解浓度(OmM,1mM,2mM,5mM,lOmM,25mM,75mM)下所得水解产物的液相色谱图以及水解产物CaAG,SDG,HDG,SDG+FeA/SDG+CouA,SDG+HMGA+CouA,SDG+HMGA，SDG+HMGA+FeA的得率,结果显示最佳碱解浓度为10mM。其中两种主要碱解产物SDG和SDG+CouA/SDG+FeA在lOmMNaOH水解条件下的得率分别为25141mg/kg和56967mg/kg。采用HPLC/MS/MS总共定性出17种不同的碱解产物,单体化合物包括SDG、HDG以及CaAG,其中有13种产物在二级质谱图中显示出清晰的碎片离子峰信息。最后考察了lOmMNaOH作为最佳碱解浓度时分离所得水解产物的稳定性,其日内RSD%变化在0.61-4.51%之间,日间RSD%变化在1.13-9.89%之间。第二部分,首先通过比较三种不同酶浓度0.01u/L,0.015u/L和0.02u/L下水解所得产物的得率,选择水解产物得率最大的0.015u/L作为最佳酶水解浓度梯度以及正交试验中酶浓度的中间值；随后通过正交实验优化酶水解亚麻籽木酚素条件得出酶浓度为0.015u/L,水解温度50℃,酶解时间4h时水解产物SDG+HMGA+FeA的含量最大为1.48mg/g；通过HPLC/MS/MS分析方法鉴定出酶解产物共14种,单体化合物包括CaAG.CouAG.HDG.SDG,其中SDG+HMGA(m/z=685.2[M-H+]-)和SDG(m/z=829.1[M-H+]-)检测出碎片峰；比较了不同酶浓度下(Ou/L,0.005u/L,0.0lu/L,0.015u/L,0.02u/L,0.025u/L,0.03u/L)亚麻籽木酚素水解产物的液相色谱图以及水解产物CaAG,HMGA+SDG,SDG+FeA,SDG+HMGA+CouA，SDG+2HMGA+EtOH,HDG+HMGA的得率,结果显示最佳酶水解浓度为0.025u/L。其中主要酶解产物CaAG和SDG+HMGA+CouA在0.025u/L酶浓度水解下得到的含量分别为7256mg/kg和2574mg/kg。第三部分,首先比较两种不同水解方法所鉴定出的共同水解产物HMGA+SDG.SDG+FeA.SDG+HMGA+CouA.CaAG的得率,结果表明四种馏分在碱水解中含量分别为4180mg/kg.56900mg/kg.2660mg/kg、6390mg/kg而酶解中含量为1211mg/kg、825mg/kg.2574mg/kg.7256mg/kg,且碱解主要产物SDG和SDG+CouA含量最大值高于酶解产物CaAG和SDG+HMGA+CouA含量的最大值。根据HPLC/MS/MS结果可以得出碱水解产物共17种而酶解产物有14种,其中有13种水解产物相同。因酶水解反应成本较碱解高且酶水解反应较繁琐周期长、产物较少,所以选择碱水解产物运用于活性评价中。第四部分,通过优化半制备液相色谱梯度洗脱条件对亚麻籽木酚素碱解产物进行分离制备,按出峰顺序收集分离色谱图中4个主要馏分,根据HPLC/MS/MS鉴定出其结构分别为SDG,SDG+HMGA+FeAG,SDG+HMGA+FeA,SDG+CouA,并采用牛津杯法、DPPH法以及MTT法分别测定4种碱解产物的抑菌活性、抗氧化活性和抗癌活性。牛津杯法抑菌实验分析表明亚麻籽木酚素4种水解产物中仅SDG和SDG+CouA对大肠杆菌有抑制作用而对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌4种水解产物均无抑制作用。通过相同浓度条件下抑菌圈大小的比较得出SDG抑制大肠杆菌的能力强于SDG+CouA,且随着质量浓度的增大抑菌作用增强,但是两种组分最低抑菌质量浓度均为5g/100mL。抗氧化DPPH·]清除实验表明亚麻籽木酚素水解产物组分皆具有[DPPH·]清除能力。SDG的清除能力接近于阳性对照品抗坏血酸,其抗氧化活性远远大于其他组分,其他3种水解产物的抗氧化活性大小依次为SDG+CouA,SDG+HMGA+FeA,SDG+HMGA+FeA。MTT法抗肿瘤活性检测表明,4种水解产物对抑制肝癌细胞smmc-7721,bcl-7402及乳腺癌细胞bcap-37这三种细胞的增殖活性无影响。
【作者】付亚琦；
【导师】张虹；
【作者基本信息】浙江工商大学，食品科学与工程，2014，硕士
【关键词】亚麻籽；木酚素；碱水解；结构鉴定；木质素降解酶水解；反相液相色谱；液相色谱串联色谱；活性评价；

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