重组腺病毒Ad-TRAIL-2A-HN对MSB-1细胞抑制作用的研究

【摘要】马立克氏病（Marek’sDisease，MD）是由马立克氏病病毒（Marek’sDiseaseVirus，MDV）引起的鸡的一种淋巴细胞增生性传染病。MD作为迄今为止唯一能应用疫苗免疫并有效预防和控制的动物病毒性肿瘤病，它对养禽业，甚至对于人类预防和控制肿瘤性疾病都具有巨大参考价值。但至目前为止，仍然没有治疗MD的有效方法，仅通过疫苗预防控制该病。腺病毒载体(Adenovirusvector，Adv)具有高效率、高滴度、低致病性及不整合入宿主细胞染色体等优点，是目前基因治疗中常用的一种有效的应用前景最广的转基因载体之一。本实验室利用已定点突变、同源重组等技术成功构建出的融合表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL）基因与新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（hemagglutininneuraminidase，HN）基因的重组腺病毒Ad-TRAIL-2A-HN，从重组腺病毒阳性质粒开始，继续研究重组腺病毒Ad-TRAIL-2A-HN的体外表达及其对肿瘤细胞生长的抑制作用，为探寻更好的畜禽肿瘤疾病的基因治疗方案奠定基础。本试验选取-80℃保存的包含重组腺病毒质粒的大肠杆菌DH5α菌株，用卡那霉素抗性筛选，重新复苏阳性菌株，提取重组质粒，经PCR鉴定和序列测定分析后。利用脂质体转染法将限制性内切酶PacI酶切回收的线性化重组腺病毒质粒转染至AD293细胞中进行包装纯化，收获的重组腺病毒能够感染AD293细胞并导致细胞发生病变，通过荧光显微技术和细胞毒性试验检测重组腺病毒感染AD293细胞后的形态变化，RT-PCR方法检测转染细胞内重组腺病毒的复制情况，结果证明本试验能够获得具有感染性的重组腺病毒，荧光显微镜下能够观察到Ad-GFP在AD293细胞内表达。用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒，并利用50%组织培养感染剂量法（TICD50）测定病毒滴度（Ad-TRAIL、Ad-HN、AD-TRAIL-2A-HN、Ad-GFP的TICD50分别为108.68TCID9450/mL、108.TCID50/mL、108.28TCID50/mL和108.86TCID50/mL）均达到试验滴度；将重组腺病毒体外感染小鼠黑色素瘤B16细胞48h后，能够通过RT-PCR检测到细胞内重组腺病毒的复制，Westernbloating检测到外源基因的表达。试验结果表明：重组腺病毒能够在体外感染培养的细胞，并能在细胞内进行复制和表达。将重组腺病毒体外感染鸡马利克氏病肿瘤细胞MDCC-MSB-1，利用MTT法检测分别感染1-7天的细胞生长抑制率，利用流式细胞术检测MSB-1细胞凋亡。试验结果显示：重组腺病毒Ad-TRAIL-2A-HN能够抑制细胞生长，在第3天达到最高值31%，细胞流式结果显示重组腺病毒促细胞凋亡率可达到11.61%。整个试验结果表明，通过对重组腺病毒质粒的包装与纯化，得到具有感染性重组腺病毒，并能够在体外培养细胞内进行表达，同时能够抑制MSB-1的生长，并能促进MSB-1细胞凋亡。本试验通过重组腺病毒Ad-TRAIL-2A-HN体外抑制马立克氏病肿瘤细胞MDDC-MSB-1生长的检测，证实重组腺病毒能够在抑制MSB-1细胞的生长，并在一定程度上体外诱导肿瘤细胞的凋亡。为进一步研究利用重组腺病毒在体内外诱导肿瘤细胞凋亡的基因治疗方案奠定了理论和实验基础。
【作者】董东晓；
【导师】金天明；
【作者基本信息】天津农学院，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】重组腺病毒；TRAIL基因；HN基因；马立克氏病；体外抑瘤作用；

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