重组金属β-内酰胺酶的制备及快速检测试纸的研制

【摘要】金属β-内酰胺酶(metallo-beta-lactamase简称金属酶、MβLs)是一类需要金属离子协助才能发挥催化活性的一类广谱β-内酰胺酶。它能够水解β-内酰胺类抗生素中的p-内酰胺环,使该类抗生素失去活性。然而目前对于金属β-内酰胺酶的活性测定缺乏有针对性的方法,普遍是借鉴测定青霉素酶酶活的碘量法进行测定。目的：建立PET21a/d-CcrA质粒在大肠杆菌BL21中的表达及纯化方法,并获得高纯度的金属β-内酰胺酶CcrA;使用传统的碘量法测定金属β-内酰胺酶的活性并进行评价；使用羟胺法对金属β-内酰胺酶进行活性测定,并优化反应条件；设计一款操作简单便捷,结果准确直观的金属β-内酰胺酶快速检测试纸。方法：将pET21a/d-CcrA质粒转化到大肠杆菌BL21细菌中,构建菌种,而后通过IPTG诱导,对目的蛋白进行大量表达。再使用超声破碎的方法,透析获得粗蛋白。粗蛋白经过Q-Sepharose柱纯化,对收集的馏分用SDS-PAGE进行鉴定,合并后超滤获得高纯度的目的蛋白；用传统碘量法对金属β-内酰胺酶进行定量测定,通过对不同批次的产品分别进行平行试验,记录检测结果进行比对；用羟胺法对金属β-内酰胺酶进行定量测定,分析各个因素对实验结果的影响,并最终确定实验的条件；在羟胺法的基础上设计金属β-内酰胺酶快速检测试纸及相关的比色卡。结果：用Q-Sepharose柱纯化分离粗蛋金属β-内酰胺酶CcrA的粗蛋白溶液,通过0-0.5MNaCl梯度洗脱,经过SDS-PAGE分析鉴定,确定0.3和0.4M洗脱峰纯度最高。而后将二者合并并分别用碘量法和羟胺法进行测量。通过对结果的分析比较发现,碘量法测定的偏差比较大,干扰因素多(实验过程需要避光,终点判断依靠个人主观认定等),而且操作麻烦时间长(5h左右),羟胺法相对的时间比较短(1.5h左右),而且干扰因素比较少,结果重复性好更为可靠(R2=0.9976),操作也比较方便,以美罗培南作为底物更有针对性。同时,本次研究还对金属β-内酰胺酶的酶活进行了重新定义,能更简单直观的反应其活性。在羟胺法的基础上,根据显色结果和酶活之间关系,设计了快速检测试纸和相对应的比色卡。进一步简化了操作的过程,为实际生产检验提供了帮助。结论：1、建立了金属β-内酰胺酶CcrA的表达和纯化方法,获得高纯度,活性高的目的蛋白溶液；2、本研究对金属β-内酰胺酶的酶活进行了重新定义,新定义更直观,简单地反应了其作用；3、设计了金属β-内酰胺酶快速检测试纸,可以对待测样品进行准确的半定量的酶活测定,为实际生产提供了一种操作简单快捷有效的方法。
【作者】韩雯；
【导师】徐志南；
【作者基本信息】浙江大学，生物工程（专业学位），2014，硕士
【关键词】金属β-内酰胺酶；CcrA；酶活测定；快速检测试纸；

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