二硫键氧化还原酶DsbA/DsbC介导重组瑞替普酶在大肠杆菌中可溶表达研究

【摘要】瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,是由第二代溶血栓药物t-PA经基因工程技术改造而来,只保留了kringleⅡ和蛋白酶两个结构域以及N末端的3个氨基酸。由于reteplase结构中含有9对二硫键,因而重组reteplase在E.coli中表达时极易形成包涵体。本文引入二硫键氧化还原酶DsbA/DsbC与reteplase共表达,介导其折叠过程中二硫键的氧化形成和错配二硫键的还原异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达,并对reteplase折叠机理进行探讨。首先根据E.coli的密码子偏好性对reteplase基因序列进行了密码子优化,并克隆到pBAD/HisA和pACYCDuet-1上,构建了DsbA、DsbC和DsbA/DsbC三种共表达体系。在此基础上,考察了发酵过程中诱导方式及时间、培养温度、诱导剂浓度等对reteplase可溶表达量的影响。通过对操作条件的优化,实现了reteplase在E.coli中的可溶表达。在37℃、200rpm的条件下培养到OD600值为0.6左右时,加入0.1mM的IPTG诱导DsbA/DsbC的表达；之后在25℃、160rpm的条件下继续培养1h后,加入0.5g/L的L-阿拉伯糖诱导目标蛋白reteplase表达,继续培养10h收获菌体,结果表明DsbC共表达体系有近60%的reteplase实现了可溶表达,其产量约为70mg/L发酵液。菌体破胞后,将上清液用镍离子亲和层析柱分离纯化reteplase,得到了较高纯度的reteplase。利用荧光光谱法对可溶reteplase的结构进行表征,发现可溶reteplase的三级结构与标准品高度一致。用平板溶圈法测得纯化后reteplase的活性为2.35×105IU/mg。最后对reteplase在DsbC的协助下二硫键异构化的两种途径进行了探讨,并阐述了异构化模型。本文通过共表达氧化还原酶DsbA/DsbC实现了reteplase在E.coli中的可溶表达,有助于reteplase的临床及折叠机理研究,对其它富含二硫键的重组蛋白质生产具有一定的指导意义。
【作者】禚孝发；
【导师】关怡新；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】瑞替普酶；二硫键氧化还原酶；DsbA/DsbC共表达体系；重组蛋白可溶表达；蛋白质折叠；

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