利用定向进化及半理性设计提高谷氨酸脱羧酶催化活性的研究

【摘要】谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase,GAD;EC4.1.1.15)能催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸(GABA),是GABA生物制备的关键酶。同时,它还是许多微生物抗酸系统中的关键酶,对微生物维持正常的生理pH值具有重要的作用。因此,对GAD进行分子改造、研究其结构—功能关系,不仅有助于为GABA的生物制备提供性能更优越的工程酶,而且对于认识GAD的生理功能,都具有重要意义。课题组在前期研究中从一株具有较高GABA发酵产量的短乳杆菌CGMCCNO.1306中克隆获得了一个编码谷氨酸脱羧酶——GAD1407——的基因,并在大肠杆菌中实现了该基因的重组表达。为了进一步改善该酶的催化性质,以更好地满足GABA生物制备的需要,本文采用定向进化、理性设计等蛋白质工程手段对该酶进行了分子改造,不仅获得了催化性能得到改善的两个突变酶——催化活力提高的突变酶Q51H和催化pH范围扩展的突变酶S307N,而且还通过对突变效应的分析,对酶的结构—功能关系有了新的认识。首先,对短乳杆菌谷氨酸脱羧酶进行了定向进化改造。采用易错PCR在目的基因中引入随机突变构建突变文库,通过高通量筛选方法进行筛选,获得了一个催化活力得到显著提高的突变酶Q51H。然后在Q51位点进行了饱和突变,并通过对饱和突变文库的筛选确定了该位点的最佳氨基酸替换类型为Q51H。对Q51H的酶学性质分析表明,该突变对酶的底物亲和力(KM)影响较小,但对转化数(kcat)影响较大(较野生酶提高了120%)。其后,采用理性设计手段对短乳杆菌谷氨酸脱羧酶GAD1407进行了进一步的改造。首先通过同源建模获得了该酶的三维结构模型,通过对该结构的分析确定了对酶的催化性质可能具有重要影响的氨基酸残基位点,然后在这些位点通过定点饱和突变技术构建了突变文库。经过筛选,从文库中获得了一个催化pH特性不同于亲本的突变酶S307N。并对突变酶的催化性质进行了较为系统的研究。同时,通过对位点D88的随机突变,证明该位点对GAD的结构和活性有重要的作用,该位点突变为其他的任何一种氨基酸都会使GAD的催化活力降低甚至失活。通过构建突变N-terminaltruncatedGAD,证明N-末端区域对GAD1407的正确折叠和可溶表达至关重要。本研究不仅获得了催化活力提高的突变酶、为GABA的生物制备创造了条件,而且还对影响GAD1407催化特性的关键氨基酸位点及区域进行了研究,丰富了对GAD1407的结构-功能关系的了解。
【作者】林玲；
【导师】梅乐和；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】谷氨酸脱羧；蛋白质工程；定向进化；定点饱和突变；酶学参数；

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