氯丙酸脱卤酶的外分泌/可溶性表达体系的构建

【摘要】S-2-氯丙酸脱卤酶、R-2-氯丙酸脱卤酶和3-氯丙酸脱卤酶在生物制备重要化工中间体方面具有广泛的用途。因此构建这些脱卤酶的高效重组表达具有非常重要的意义。目前脱卤酶重组表达基本都选择大肠杆菌作为宿主,在原核体系中进行重组表达存在酶活力较低、易产包涵体等不足。胞外重组表达或者选择合适的载体、宿主胞内重组表达能够较好的解决以上问题。本文构建并优化了2-氯丙酸脱卤酶的毕赤酵母外分泌表达体系。分别将S-2-氯丙酸脱卤酶和R-2-氯丙酸脱卤酶的基因克隆、构建到pPIC9K载体,线性化后电转化到毕赤酵母GS115中。通过G418抗性YPD平板多次筛选得到含12个拷贝重组子,甲醇诱导实现胞外活性表达。对重组S-2-氯丙酸脱卤酶,重点考察了基因拷贝数、甲醇浓度和诱导温度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,最适甲醇浓度为1%,30℃诱导时,重组脱卤酶的酶活力最高,可达236U/L,其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5；而重组R-2-氯丙酸脱卤酶酶活为94U/L。重组子的遗传稳定性均非常好。针对3-氯丙酸脱卤酶,本文分别从启动子,分子伴侣,稀有密码子补充等方面出发,先后尝试选择多种载体、宿主菌,构建了7个大肠杆菌重组菌。其中Rosetta(DE3)pLysS-PcoldTF-BHD重组菌可溶表达结果最好,其目标蛋白表达量为0.96g/L,相比原来提高近一倍,酶活力为6.02U/L,相比原来提高38%。由于该重组菌含有分子伴侣TF,能够帮助3-氯丙酸脱卤酶目的蛋白正确折叠,同时Rosetta(DE3)pLysS宿主含有多种稀有密码子补充,有利于含大量稀有密码子的3-氯丙酸脱卤酶的可溶表达。
【作者】秦迎春；
【导师】吴坚平；杨立荣；徐刚；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】2-氯丙酸；3-羟基丙酸；脱卤酶；毕赤酵母；重组表达；

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