农药氟虫腈作用下斑马鱼microRNA-155对cyb561d2的调控作用研究

【摘要】MicroRNA（miRNA）是一类长为20~24nt的单链非编码小分子RNA，主要存在于真核生物中，具有组织特异性、无开放阅读框等特点，在转录或翻译水平调控基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡，并与炎症、肿瘤等疾病的发生、发展密切相关。环境毒理学研究表明，当生物细胞或组织暴露于环境化学物质时，会引起相关miRNA的表达发生变化，进而导致其靶基因表达发生变化。因此，有必要明确环境化学物质、miRNA及其靶基因三者间的作用关系。在环境毒理学研究和环境监测中，miRNA可作为识别环境中化学物质基因毒性和致癌性的生物标记物，并可用于预测环境化学物质对生物体的毒性。课题组使用基因芯片方法研究了三唑磷微乳剂、氟虫腈微乳剂及两者的混合物对斑马鱼（Daniorerio）miRNA表达的影响，结果显示219条待测miRNA中，21条miRNA表达发生了变化，其中氟虫腈作用可导致斑马鱼miR-155的显著下调。在本研究中，我们通过生物信息学方法，预测cyb561d2为miR-155的一条潜在靶基因，而cyb561d2是细胞色素b561的家族成员，主要功能为跨膜电子传递、抗环血酸的再生和平衡并参与细胞防御以及应答环境化学物质的刺激。我们將斑马鱼暴露于不同浓度的氟虫腈中，通过荧光定量PCR发现，随着氟虫腈处理浓度从0.015mg/L提高到0.480mg/L，斑马鱼miR-155表达量持续下调，从0.96下调至0.24，而cyb561d2表达量则从1.94倍升高至4.17倍；采用Westernblot检测cyb561d2蛋白表达量，随着氟虫腈处理浓度从0.015mg/L提高到0.480mg/L，其表达量从1.46倍升高至3.45倍。为验证信息学手段的预测结果，并解释氟虫腈处理的共表达变化，我们成功构建四种重组海肾荧光素酶载体：1）包含全长3’-UTR序列；2）仅包含miR-155推定结合位点及其邻近核苷酸序列；3）包含3个首尾串联的miR-155推定结合位点序列；4）包含敲除miR-155推定结合位点的3’-UTR序列，并分别与pGL3-control、miR-155mimic共转染进入293T细胞，利用双荧光素酶报告基因法验证了斑马鱼cyb561d2的3’-UTR存在miR-155直接结合位点，为miR-155的靶基因。为明确斑马鱼miR-155对cyb561d2基因以及cyb561d2蛋白的负向调控作用，我们通过转染化学合成的miR-155mimic及可以抑制内源性miR-155表达的miR-155inhibitor，引起斑马鱼胚胎细胞ZF4内miR-155的异位表达，发现转染miR-155mimic的实验组，cyb561d2mRNA的表达水平仅为阴性对照组的0.29，其蛋白表达水平为阴性对照组的0.61，均显著下调；而转染miR-155inhibotor的实验组，其cyb561d2mRNA的表达水平则是对照组的7.71倍，其蛋白表达水平为阴性对照组的2.78倍，均显著上调。为明确斑马鱼miR-155对氟虫腈作用下ZF4细胞增殖的影响，我们使用MTT法测定了斑马鱼ZF4细胞氟虫腈暴露的IC50值为17.1mg/L，并研究了异位表达的miR-155对处于IC50氟虫腈浓度暴露下的斑马鱼细胞的增殖及存活率的影响，发现miR-155显著降低了ZF4细胞的增殖及存活率，而抑制内源miR-155的表达，则可以显著增强细胞的增殖及存活率。因此，miR-155可作为暴露于氟虫腈环境的生物标志物。考虑到miRNA与其靶基因不是一一对应的关系，我们通过生物信息学软件预测到斑马鱼cyb561d2的靶miRNA可能还包括miR-499、miR-429、miR-216b、miR-200b、miR-200c以及miR-194a。
【作者】黄涵年；
【导师】郭江峰；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】miR-155；cyb561d2；靶基因；细胞增殖；基因毒性；生物标志物；氟虫腈；斑马鱼；

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