苦豆子内生真菌遗传多样性及其产喹诺里西啶生物碱菌株的筛选

【摘要】植物内生真菌普遍存在于目前发现的各种陆生及水生植物中,其多样性受多种因素的影响。不同的区域或位点、气候条件、植被等均可影响内生真菌类群的多样性。研究发现,药用植物中蕴含着大量的有益内生真菌,这些内生真菌与宿主之间具有紧密的生态关系,其产生的次生代谢产物在医药、植物病虫害生物防治等方面的用途逐渐增大,成为寻找新的天然活性产物的重要方向。本文以宁夏灵武白芨滩自然保护区重要的沙生药用植物苦豆子为研究对象,进行了苦豆子内生真菌的分离、鉴定、遗传多样性及生态分布研究；苦豆子生物总碱中单碱检测体系的优化,以及产喹诺里西啶生物碱内生真菌菌株的筛选和rDNA-ITS序列分析。研究结果如下：1、从宁夏灵武白芨滩自然保护区不同土壤、不同优势植被类型的6个样区采集的健康苦豆子,分离得到213株内生真菌。同一植株不同组织中,内生真菌数量以根部最多,其次为种子,叶部最少；淡灰钙土中苦豆子内生真菌数量比风沙土中多；形态学鉴定结果表明,内生真菌以镰刀菌属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)和茎点霉属(Phoma)为优势属,其中镰刀菌属(Fusarium)在各样区中均有分布。2、宁夏灵武白芨滩自然保护区6个样区苦豆子内生真菌具有丰富的种群组成,分离的213株内生真菌菌株经：rDNA-ITS序列鉴定分为19个属32个种,其中腐皮镰刀菌Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、交链格孢(Alternariaalternata)、细极链格孢(Alternariatenuissima)和草茎点霉(Phomaherbarum)为优势种。3、建立TLC和HPLC同时分离测定苦豆子生物碱体系的优化方法。薄层层析法(展开剂为氯仿-甲醇-氨水=8：2：0.1)；高效液相色谱法的色谱柱为UltraIITMC18(5μmx250mmx4.6mm)、流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲液-甲醇(45：55)、检测波长为216nm、流速为1.0mL/min、柱温为30℃、进样量为10μL。槐定碱和苦参碱在200-900μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系,R2分别为0.9994和0.9996,平均回收率(n=9)分别为99.47%和99.82%。4、从59株苦豆子内生真菌代表菌株中,经TLC初步筛选,HPLC对其菌丝体提取物进行分析,筛选出1株高活性产喹诺里西啶生物碱菌株XKYKDF40,其发酵液氧化苦参碱含量为145.73μg/mL。经形态学和分子生物学鉴定,菌株XKYKDF40为外瓶霉属(Exophiala)的一个种,与一种被称之为真菌蚂蚁体内分离出的内生真菌Exophialaspp.Attineants相似性最高,相似率为98%。
【作者】周星辰；
【导师】顾沛雯；
【作者基本信息】宁夏大学，农业昆虫与害虫防治，2014，硕士
【关键词】苦豆子；内生真菌；rDNA-ITS序列分析；产喹诺里西啶生物碱菌株；筛选；

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