奶牛乳腺炎大肠杆菌优势血清型相关毒力基因与耐药基因的检测与序列分析

【摘要】本研究利用宁夏地区临床型奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株,采用O抗原平板凝集试验鉴定大肠杆菌优势血清型,应用纸片扩散法对其耐药性进行分析,运用PCR方法对耐药基因以及毒力基因进行检测,并对血清型和耐药性之间的关系,以及irp2、iucA两种毒力基因的序列进行了分析比对,实验结果如下：1.根据GenBank报道的序列,设计大肠杆菌16SrRNA鉴定的通用引物,应用16SrRNA鉴定大肠杆菌的方法,鉴定本实验室收集到的173株临床型奶牛乳腺炎肠杆菌科细菌,最终鉴定出107株大肠杆菌。2.根据相关文献报道,选取30种大肠杆菌O抗原血清,对107株奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株进行O抗原血清鉴定。鉴定结果表明,107株奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株中共有78株被鉴定出血清型,优势血清型有0101(15/78)、0158(15/78),另外检出较多的有053(8/78)、010(7/78)、086(5/78)、O92(6/78),占定型株的71.8%,29株未定型。3.采用CLSI推荐的纸片扩散法,对107株临床型奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株进行了11种药物的药敏试验。结果表明,分离菌株对11种抗菌药物具有不同程度的耐药性,其中对复方新诺明耐药率达到94.4%,对四环素达到90.7%,对庆大霉素达到86.9%,对氨苄青霉素和阿莫西林均达到93.5%,另外对强力霉素,卡那霉素也达到60%以上,其他几种药物也达到较高水平。这107株大肠杆菌共出现53种耐药谱,并未出现1耐、2耐以及11耐的菌株。耐药类型最少的是0耐(仅1株),最高的达到10耐。4.根据GenBank报道的相关序列,设计磺胺类：sull、sul2、sul3;四环素类：tetA、tetB、tetE;氨基糖苷类：aadA1、aadA2、aadB、aadD、aacC2、aacC4、aac(3)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa,aph(3)-Ⅱa;β-内酰胺类：CTX-M、SHV、OXA、TEM;毒力基因：irp2、fyuA、eaeA、ler、F41、LT1、ST1、iucA、iucB、iutA的PCR反应特异性引物,建立了相应的PCR检测方法。结果表明,该方法灵敏可靠,可以用作临床检测的方法使用。对107株奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株进行检测,共检测到14种耐药基因,7种毒力基因,分别为,sul1(31.8%)、sul2(37.4%)、sul3(2.8%)、tetA(17.8%)、tetB(14.0%)、aacC2(32.7%)、aacC4(13.1%)、aadA1(9.3%)、aadA2(10.3%).aadB(38.3%)、aac(3)-Ⅱa(27.1%)、CTX-M(10.3%)、OXA(8.4%)、TEM(47.7%)、irp2(49.5%)、fyuA(49.5%)、ler(3.7%)、eaeA(3.7%)、iucA(38.3%)、iucB(56.1%)、iutA(49.5%)。而其他8种基因未检测到。5.对优势血清型0158、0101的30株大肠杆菌,分别扩增其irp2以及iucA两种基因并测序,之后对其序列进行分析,基因序列分析结果表明,两种基因与GenBank报道的序列同源性非常高,irp2达到95.9%以上,而iucA达到98%以上。此外,两种基因的不同序列中均出现规律性的突变,其中irp2基因共出现6种序列,其中有3种序列均出现279位点附近4个碱基的缺失以及531位点的AT突变为TC。全部6种序列中,都在304位点出现A突变为C,343位点C突变为A,346位点A突变为G,376位点A突变为C以及518位点的T突变为C。而iucA基因共出现4种序列,其中iucA-2、iucA-3、iucA-4在751位点出现C突变为G,而iucA-1、iucA-2、iucA-4在1089位点出现T突变为C,4种序列全部在1037,1042,10473个位点出现A突变为G。
【作者】马超；
【导师】许立华；邓光存；
【作者基本信息】宁夏大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】奶牛乳腺炎；大肠杆菌；O抗原血清型；耐药基因；毒力基因；序列分析；

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