基于疏水蛋白HFBI在烟草中表达Reteplase的研究

【摘要】急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓栓塞性疾病的致残率和致死率都很高,严重威胁着人类健康及生命。Reteplase是临床上治疗血栓性疾病的常用药物。当前商品化的Reteplase药物是经由大肠杆菌表达系统获得的,其表达产物非糖基化,后续复性纯化的收率不高且价格昂贵。因此,探索和研究新型、高效的表达系统是解决上述问题的关键。本实验室曾尝试利用烟草花叶病毒(TobaccoMosaicVirus,TMV)载体表达系统在烟草中表达Reteplase。开究结果表明利用植物作为生物反应器表达Reteplase是可行的,但是利用TMV病毒载体表达系统在烟草中表达的Reteplase有严重的降解现象。鉴于此,本研究探索了基于疏水蛋白HFBI在烟草中表达Reteplase的可行性。以GFP为报道基因,首先对HFBI融合表达外源基因的效果和特点进行了研究。利用农杆菌渗滤技术,将GFP-HFBI植物表达载体分别接种本氏烟和普通烟(白肋)植株叶片。通过整株和细胞水平对烟草接种部位荧光信号的比较,从两个备选表达寄主中选择本氏烟作为HFBI融合表达外源基因的的宿主植物。整株、细胞和分子(蛋白质)水平的比较实验结果表明,在整个实验观察期内,GFP-HFBI的荧光信号/表达量在各个时间段均明显高于GFP。结果证明,HFBI的融合表达可以有效地提高外源基因在烟草植物中的表达水平。通过在核酸(mRNA)和蛋白质水平对烟草中GFP和HFBI-GFP不同时期表达积累水平同时进行比较分析,推测HFBI是在翻译水平而不是转录水平发挥作用来提高外源基因在植物烟草中的表达水平。进一步的细胞水平的观察结果显示,HFBI融合表达的GFP烟草叶片细胞中可以看到大量致密的绿色荧光蛋白颗粒,而对照组则观察不到此现象。认为由于HFBI本身具有疏水和易聚集的特性,HFBI融合表达产物在细胞内形成不溶性的聚集物,进而在一定程度上隔绝了宿主细胞内源性蛋白酶对表达产物的降解,从而实现外源基因表达产物在细胞内的长期持续积累,通过累积效应,外源基因表达水平得到了提高。在上述研究结果的基础上,开展了基于HFBI在烟草中融合表达Reteplase的研究。以普通烟的密码子使用频率为标准对Reteplase编码基因序列进行密码子优化和基因合成,并利用亚克隆技术构建了Reteplase的HFBI植物表达载体。表达产物的SDS-PAGE和westernblot实验结果表明,基于HFBI融合表达可以在本氏烟中表达出Reteplase,其表达量约为5.0μg/g鲜叶。体外生物学活性实验显示,在烟草中表达的Reteplase具有体外溶栓活性,且N末端融合表达的HFBI标签未对Reteplase的生物学活性产生明显的影响。综合实验结果和生物信息学预测结果,推测在烟草植物中基于HFBI融合高表达GFP(2.5mg/g鲜叶)和低表达Reteplase(5.0μg/g(?)叶的可能原因两个,其一是因密码子的优化而产生了潜在的内含子剪接位点；其二是Reteplase基因原有的信号肽序列不能被植物正确的识别和切割。研究结果对深入了解基于HFBI的融合表达,指导其他具有商业价值的外源基因表达具有理论意义和实际的应用价值。同时,也为Reteplase的研究提供了一个可供选择的表达系统。
【作者】牟红珍；
【导师】王盛；
【作者基本信息】宁夏大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】瑞替普酶；绿色荧光蛋白；HFBI融合表达；烟草；

【参考文献】
[1]石潇.论歌剧《悲怆的黎明》女主角的艺术形象与唱段分析[D].西安音乐学院,声乐演唱与表演,2014,硕士.
[2]盛婴.父母的个体特质元情绪与5-6岁幼儿情绪调节策略的相关研究[D].华东师范大学,学前教育学,2013,硕士.
[3]车轩,胡铁森,张敏.一种OFDM系统PAPR抑制技术联合算法研究[J].无线电通信技术,2015,02:29-31.
[4]王贵参.基于改进连接聚类的重叠社区探测方法研究[D].吉林大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[5]周红芳,周扬,张晓鹏,谈姝辰.基于连通分量的分类变量聚类算法[J].控制与决策,2015,01:39-45.
[6]谢文婷.南京市低碳城市发展水平评价及对策建议[D].南京师范大学,人文地理学,2012,硕士.
[7]孙荣富,张涛,梁吉.电网接纳风电能力的评估及应用[J].电力系统自动化,2011,04:70-76.
[8]柏菁.中国小麦市场整合研究[D].南京农业大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[9]傅海瑛.知识管理:公共行政组织变革与创新[D].上海师范大学,2003.
[10]丁磊.基于红外传感的温度检测与传输系统设计[D].安徽大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[11]邢晓彤.高铁竞争背景下的机票折扣定价策略研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2013,硕士.
[12]杜峰.辣椒茸毛性状的初步研究[D].湖南农业大学,蔬菜学,2004,硕士.
[13]裘聿皇,张本勇.(J,J′)-无损因子分解中的若干问题研究[J].自动化学报,1997,06:124-126.
[14]黄广飞.社会组织党建科学化研究[D].中共广东省委党校,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[15]杨峘.行为治疗对复发精神分裂症及抑郁症患者效果及过程研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[16]王庆兴.寻常型银屑病寒包火证形成危险因素的Logistic回归分析[D].河南中医学院,中医外科学,2013,硕士.
[17]刘玉忠,张霄力,赵军.一类线性开关系统的渐近稳定性[J].控制与决策,2002,01:111-113+116.
[18]王娟.几种聚噻吩衍生物的合成与表征[D].天津理工大学,药物化学,2012,硕士.
[19]孔德智.小城镇中心区城市设计理论方法及控制导则研究[D].浙江大学,2006.
[20]马悦.“白话”作为民间的话语表达[D].华东师范大学,文艺学,2013,硕士.
[21]苑亚斐.氧化锌复合纳米材料的制备及其光催化性质的研究[D].河南师范大学,2012.
[22]王立伟.基于改进粒子群算法的配电网络重构研究[D].天津大学,电气工程,2013,硕士.
[23]邹东升.数据挖掘在电信告警中的应用研究[D].重庆大学,2002.
[24]李宏泽.冠粤公司产权制度改革中员工关系管理案例研究[D].华南理工大学,高级管理人员工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[25]武鹏程,袁兆山.混合关联规则及其挖掘算法[J].小型微型计算机系统,2003,05:895-898.
[26]李国新.基于分布式粒子滤波的无线传感器网络目标跟踪算法研究[D].长安大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[27]周铉.我国侵权责任抗辩事由研究[D].扬州大学,民商法学,2012,硕士.
[28]田姣.石墨烯—聚苯胺杂化材料的可控合成及其电化学性能[D].南京理工大学,2012.
[29]郭超.富锂型层状过渡金属嵌锂氧化物的制备与性能研究[D].济南大学,2014.
[30]郭春燕.20世纪三四十年代陕西省银行业与区域经济研究[D].宁夏大学,专门史,2014,硕士.
[31]杨春梅.基于FPGA芯片的1000M光以太网自适应技术的设计与实现[D].成都理工大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[32]程焕焕.B2C模式下网购顾客满意度测评研究[D].山东财经大学,企业管理,2014,硕士.
[33]王君.技术性贸易壁垒的伦理问题研究[D].南京师范大学,伦理学,2012,硕士.
[34]王小辉.沉浸式公共空间色彩规划与设计研究[D].华中科技大学,艺术学,2013,硕士.
[35]宋冰.汽车按键开关测试系统的开发[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[36]陈晨.双重身份与道德困境[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[37]高银中,雷小强,杨江天.基于泵示功图的抽油机井井口产量计算[J].石油矿场机械,2008,05:88-92.
[38]张峻,席裕庚.基于几何分析的约束预测控制直接算法[J].控制与决策,1997,02:184-187.
[39]郑传东.参附对体外循环二尖瓣置换术心肌缺血—再灌注损伤的保护作用及其对术后疲劳综合征的影响[D].重庆医科大学,麻醉学,2004,硕士.
[40]李海舰,聂辉华.论企业与市场的相互融合[J].中国工业经济,2004,08:26-35.
[41]毛林林,王存国,袁维娜,温振凤,路乃群.锂离子电池正极材料LiFePO_4的改性研究进展[J].化工科技,2011,05:55-60.
[42]王向红.洗涤方式的研究及新型家用洗碗机的研制[D].广西大学,机械电子工程,2004,硕士.
[43]辜智慧,陈晋,史培军,徐明.锡林郭勒草原1983～1999年NDVI逐旬变化量与气象因子的相关分析[J].植物生态学报,2005,05:753-765.
[44]朱宁.风力发电PWM变流器及其控制策略[D].北京交通大学,2007.
[45]韩谷秀.氨肽酶底物的合成与应用[D].江西科技师范大学,应用化学,2012,硕士.
[46]姜合,徐坤忠.Web使用挖掘研究[J].山东轻工业学院学报(自然科学版),2002,03:49-53.
[47]柴瑛.立体童书设计研究[D].河北大学,出版,2014,硕士.
[48]陈生昌,毕亚杰,林晨.地震观测系统评价的波动方程方向照明方法[J].石油地球物理勘探,2009,06:656-661+783+643.
[49]陈晓晓,李鹏.两岸大学生志愿服务动机与激励机制比较研究[J].当代青年研究,2014,02:101-105.
[50]李颖,杨娜.冷弯薄壁背靠式组合受弯构件数值模型中栓钉模拟方法的研究[J].特种结构,2014,01:37-43.