U6 ncRNA对TMV病毒表达载体作用研究

【摘要】随着基因工程的发展,利用植物作为生物反应器生产外源蛋白的研究因其广阔的商业前景在世界范围内受到广泛的重视。植物RNA病毒载体表达体系是利用植物生产外源蛋白的一个新兴的、极具潜力的平台。但是,在长期的植物病毒和寄主互相过程中,寄主植物进化产生的多种针对植物RNA病毒的抗病机制,会严重地影响病毒载体介导的外源基因的表达水平。本研究以核孔运输原理为依据,用AssemblyPCR技术合成拟南芥U6-1基因,并构建RNA聚合酶Ⅱ介导转录的U6RNA瞬时植物表达载体。以农杆菌渗滤法与烟草花叶病毒(TMV)病毒表达载体共接种烟草,通过比较分析接种烟草中报道基因GFP的表达变化规律,研究了非编小RNA-U6对TMV病毒表达载体作用效果。实验结果如下：1.利用AssemblyPCR技术,通过设计的三对引物(两对合成引物和一对筛选引物),经过组装和筛选2步PCR反应,在体外合成了拟南芥U6-1基因序列；并通过亚克隆技术构建了Ⅱ型启动子介导的U6RNA植物瞬时表达载体pBIN19U6。2.利用农杆菌渗滤技术将U6RNA植物瞬时表达载体pBIN19U6与TMV病毒表达载体pJLTRBO-G共接种寄主植物本氏烟。结果表明,在适宜的TMV病毒表达载体接种浓度下(OD600=0.008),共表达U6ncRNA对TMV病毒表达载体表达外源基因的水平有着明显的增效作用。3.病程相关蛋白(Pathogenesis-relatedproteins,PR)PR2的、Westernblots检测结果表明,共表达U6ncRNA可以有效的抑制PR2蛋白质的表达水平。证明Ⅱ型启动子介导转录的U6RNA竞争性地影响核孔运输,从而抑制宿主防御性相关RNA从核孔的输出,进而提高植物病毒表达载体侵染的成功率,最终获得外源基因的高效表达。4.共接种U6ncRNA后外源基因表达的时间变化规律研究表明,U6ncRNA对提高病毒载体介导的外源基因表达水平的作用仅在接种前期(接种后2-5天)比较明显,推测U6ncRNA的增效具有时间效应。5.与黄瓜花叶病毒(CMV)编码基因沉默抑制子2b蛋白的比对研究表明,其提高载体表达水平的能力与病毒编码的基因沉默抑制子相当。
【作者】丁国平；
【导师】王盛；
【作者基本信息】宁夏大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】烟草花叶病毒；表达载体；U6非编码RNA；核孔输出；本氏烟；

【参考文献】
[1]马娟.我国企业破产重整计划批准制度的法律分析[D].兰州大学,民商法学（专业学位）,2013,硕士.
[2]魏晨熙.Q460高强度钢材焊缝连接受力性能和计算模型研究[D].清华大学,土木工程,2013,硕士.
[3]李师仑.瑞典的节能[J].煤炭科学技术.1987(08)
[4]平青.群体知识表征一致性度量及实证研究[D].大连理工大学,信息管理与电子政务,2013,硕士.
[5]邓永红.银杏叶胶囊对眼压控制青光眼患者视野平均缺损指数影响的研究[D].成都中医药大学,中医五官科学,2012,硕士.
[6]曹群.基于产业链整合的产业集群创新机理研究[D].哈尔滨工业大学,2009.
[7]冯玲.美国医疗知情同意制度研究[D].浙江工商大学,民商法学,2013,硕士.
[8]李晓东.基于相位群同步的任意频率测量研究[D].西安电子科技大学,测试计量技术及仪器,2012,硕士.
[9]唐艳艳.基于反射干涉光谱的微芯片传感器在微生物分析中的应用[D].浙江大学,化学,2013,硕士.
[10]聂良兵.三自由度运动平台运动仿真及控制研究[D].西南交通大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[11]王雪梅,刘红.锯齿型石墨烯纳米带的能带研究[J].物理学报,2011,04:554-563.
[12]段颖芬.鼠伤寒沙门氏菌适配体的筛选及应用研究[D].湖南师范大学,微生物学,2014,硕士.
[13]张星星.唐前诗序流变研究[D].广西师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[14]李承彪,杨玉坡.四川省马尾松天然更新规律性的初步研究[J].植物生态学报,1966,00:142-150.
[15]李阳.云计算中数据访问控制方法的研究[D].南京邮电大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[16]俞维玲.On Pragmatic Translation from the Viewpoint of Relevance Theory[D].安徽大学,语言文学,2003,硕士.
[17]杨玉青.区域配电网储能配置与优化运行策略研究[D].北京交通大学,2015.
[18]吴少海.青藏铁路多年冻土区桥梁设计特点[J].中国铁路.2002(09)
[19]张晨.民办幼儿园师资管理问题研究[D].郑州大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[20]王慧姝.甜菜夜蛾对寄主植物的适应性研究[D].黑龙江大学,农业推广,2012,硕士.
[21]孙天航.基于PLC和变频器控制的恒压供水系统[J].中外企业家,2015,15:178.
[22]李国栋.我国环境污染强制责任保险制度研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[23]李红.浙江省出口商品结构优化的实证研究[D].东华大学,国际贸易学,2013,硕士.
[24]何雨莲,罗鸿禹,李静,李卓,李剑峰.全光纤高功率被动锁模掺铥光纤激光器[J].强激光与粒子束,2014,10:102-106.
[25]刘晔.旅游合同法律问题研究[D].北方工业大学,民商法学,2014,硕士.
[26]胡奇锋.永磁同步电机高性能调速控制系统研究[D].浙江大学,电机与电器,2004,硕士.
[27]崔勇.实验室常用质粒对宿主大肠杆菌MG1655全菌蛋白表达谱影响的研究[D].安徽大学,微生物学,2014,硕士.
[28]樊立萍,于海斌,袁德成,王秀兰.SBR污水生化处理系统的最优控制及改进[J].控制与决策,2005,02:237-240.
[29]邴特.在高校羽毛球教学中常见的运动损伤及预防[D].吉林体育学院,体育人文社会（专业学位）,2013,硕士.
[30]朱俊.液压支架立柱液压系统的仿真研究[D].郑州大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[31]姜军,张波,徐海涛,林璐璐,汤一平.双目立体全景视觉传感器的三维测量精度的研究[J].计算机测量与控制,2012,02:335-338.
[32]张亚丽.类风湿关节炎手部超声改变与中医证型相关性研究[D].广州中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[33]李湘祁.美国女子成才障碍研究的现状与趋势[D].首都师范大学,比较教育学,2004,硕士.
[34]黄益强.径向道时频峰值滤波压制地震勘探随机噪声的初步研究[D].吉林大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[35]林俊.研究矩阵代数正映射的新工具[D].曲阜师范大学,基础数学,2013,硕士.
[36]侯璐.阴离子—非离子型不对称Gemini表面活性剂的合成与性能研究[D].中北大学,化学工程,2014,硕士.
[37]余丹.九龙江口秋茄红树林土壤-大气温室气体通量随植被恢复变化的研究[D].厦门大学,环境工程,2014,硕士.
[38]吴乐.十二羰基三铁与取代炔烃（RCCR’）的反应性能研究[D].内蒙古工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[39]冯朝朝.应力扰动敏感型巷道围岩变形破坏机理及分区支护技术[D].中国矿业大学,采矿工程,2014,硕士.
[40]龙婧.隆基泰和有限公司房地产开发业务的税收筹划方案研究[D].兰州大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[41]马业香.犬前列腺炎的人工发病及其B超检查的特点分析[D].南京农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[42]于淑玲.小兴凯湖表层沉积物的磷释放特征及对富营养化的影响研究[D].中国科学院研究生院（东北地理与农业生态研究所）,环境科学,2014,硕士.
[43]胡敏,蔡慧芬.基于形态学标记连通的分水岭图像分割[J].电子测量与仪器学报,2011,10:864-869.
[44]孙骥.不同体积淤血对大鼠部分肝切除后早期肝再生的影响[D].川北医学院,外科学,2014,硕士.
[45]夏文荣.上海市计划生育药具公共服务研究[D].吉林大学,社会医学和卫生事业管理学,2014,硕士.
[46]徐文胜.中国饭店业集团化发展状况分析及战略研究[D].中南林学院,森林经理学,2003,硕士.
[47]李翰飞.青少年羞耻感倾向与核心自我评价的关系研究[D].西南大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[48]杨红超.浅谈“方案式”雕塑创作方法[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[49]闫新民.冰雪清凉物细说各不同[J].世界标准信息.2005(05)
[50]胡琛,唐晓波.数据仓库技术在配电线路电量管理系统中的应用[J].电力需求侧管理,2004,02:22-25.