雷帕霉素在BCG感染巨噬细胞过程中的调控作用研究

【摘要】Mycobacteriumtuberculosis(MTB)causedTB,itisachronicinfectiousdiseaseofzoonotic.MTBisatypicalcellularparasite,MTBinteractionwithhostmacrophagesincidenceoftuberculosisandthepathologicaldevelopmentplaysanimportantroleinmanyintracellularsignalingmoleculeshavebeenshowntoparticipateinthispathogen-hostinteraction.Mammaliantargetofrapamycin(mTOR)signalingpathwaysregulatingcellgrowthandproliferationisakeysignalingpathways.Intheimmunesystem,mTORsignalingpathwayinstimulatingandregulatingtheinflammatoryresponsealsoplaysanimportantrole.mTORinhibitorrapamycincanaffectLPS-inducedapoptosisinmacrophagesNOproductionormacrophagesthroughdifferentmechanisms,butonrapamycininBCGinfectionofmacrophagesandcellsforNOregulationofapoptosishasnotbeenreported.1.Inorderoffullyexperimentalmaterials,wewereculturedBCGinsolidcultureandliquidculture.Duringculturedinliquid,weaddtheglycerinandTween-80intwodifferentculturemedia.WefoundthatinliquidcultureaddedTween-80evenmoresuitableforthegrowthofBCG,andcanprovideagoodfoundationforthesubsequentexperiments.InthecountofBCG,wetookthreedifferentcountingmethods:turbidimetry,acid-faststainingandFDAstaining;andcounttheresultsofthesethreemethodswerestatisticallyandcompared.WefoundthatFDAstainingandacid-faststainingismoresuitableforBCGcounts,especiallyFDAstainingcanbemoreaccuratecountofthenumberofviablecellsofBCG2.WestudiedtheeffectsofrapamycininthecourseofBCGinfectioninRAW264.7cellstoproducetheamountofNOandinduciblenitricoxidesynthase(iNOS)mRNAandproteinexpressioninLPS-stimulatedsimultaneouslysetupthecontrolgroup.Theresultsshowedthat,comparedwiththecontrolgroup,BCG,LPSstimulationof6,12and24hcanproduceasignificantincreaseinthelevelsandtheexpressionofNO,iNOSmRNAandproteininRAW264.7cells(P<0.01).Comparedwiththegroupwithoutaddingrapamycin,BCGinfectionduring6and12h,10nmol/LrapamycincansignificantlyinhibittheexpressionofNOandiNOSinRAW264.7cells(P><0.01),however,at24hrapamycininhibitionofstimulatedNOproductionwasnotsignificant(P>0.05),butthesamecansignificantlyinhibittheexpressionofiNOS(P<0.01).LPSstimulationof6and24hafter,10nmol/LrapamycincansignificantlyinhibitedNOproductioninRAW264.7cells(P<0.01);during12h,significantlyinhibitedNOproduction(P<0.05).WhenLPSstimulationrapamycininhibitedtheexpressionofiNOS6hwhenthedifferencewasnotsignificant(P>0.05),12and24h,thedifferencewassignificant(P<0.01).3.TheeffectsofrapamycinBCGinfectioninRAW264.7cellsonapoptosis.Theresultsshowedthatwithin1nmol/L-lμmol/Lconcentrationrangeof10nmol/Lrapamycininhibitionofapoptosismostsignificant(P<0.01).FlowcytometryshowedtheimpactofrapamycinonapoptosisBCGinfectionbypromoting6hat24handgraduallytransformedintoinhibitionwhen;whiletheLPS-treatedgroup,rapamycinoncellswitherdeathwasnosignificantdifference(P>0.05).BydetectingNF-κBactivationlevelsfoundafterBCGandLPStreatmentcansignificantlyimprovetheactivityofNF-κB(P<0.01orP<0.05),andrapamycinonBCGtreatmentgroupsNF-κBactivity6hwhentheinhibitoryeffectofpromotingagradualturnat24h,butintheLPS-treatedgrouphasbeendoingtopromotetheroleofNF-kBactivity(P<0.01).FurtherusingELISAmethodtodetectthecellsproduceTNF-alevels,theresultsshowthatwhenthe6hrapamycinpromotethegeneration(P<0.05orP<0.01)TNF-astimulationafterBCGandLPSinfection,but12and24htherewasnosignificantdifference(P>0.05).Indealingwith24hofapoptosis-relatedproteinCaspase-3analysisfoundthatrapamycinafterBCGinfectioncaninhibitCaspase-3activity,mRNAandproteinexpression(P<0.05orP<0.01);ButafterLPSstimulationinhibitionwasnotsignificant(P>0.05).Inaddition,rapamycinalsosignificantlyinhibitedtheBCGinfectionafter24hintheG1phaseofthecellcyclethecelloccupiedbytheratio(P<0.01).
【作者】张文清；
【导师】王玉炯；何玉龙；
【作者基本信息】宁夏大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】BCG；rapamycin；nitricoxide；apoptosis；

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