海洋卡拉胶降解菌Cellulophaga sp.KL-A的筛选优化及卡拉胶酶研究

【摘要】卡拉胶(Carrageenan)是一种亲水性的多糖物质,从某些海藻细胞壁提取的、由β-1,3-D-半乳糖和α-1,4-D-半乳糖为基本骨架,交替连接所形成的线性硫酸多糖,主要分为三类：λ-(Lamda)型、ι-(Iota)型和κ-(Kappa)型。卡拉胶的降解产物寡糖具有广泛的生物活性,如免疫调节、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒等作用。卡拉胶降解酶是一种多糖水解酶,通过作用于卡拉胶的p-1,4糖苷键来水解卡拉胶,其水解产物主要为偶数卡拉胶寡糖。目前已报道的卡拉胶酶都归属于糖水解酶家族。对不同类型的卡拉胶酶结构及其功能、底物专一性等研究,具有重要的理论意义和实践价值。另外,利用卡拉胶酶也可以对卡拉胶硫酸基团的结构和功能之间的关系进行研究,对卡拉寡糖工业化应用、细菌卡拉胶代谢研究等方面也具有重要意义。而且酶解法制备卡拉胶寡糖的底物专一、条件温和,能解决传统化学和物理降解法不易控制、产物分布不均匀的缺点,从而为进一步研究卡拉胶寡糖的生物活性提供帮助。本论文从漳州市东山岛海域海水、养殖海水及红藻藻体上分离得到8株具有卡拉胶及琼胶降解功能的菌株,其中一株编号KL-A经平板划线,根据平板上水解圈的大小及发酵液酶活力的测定发现具有良好的专一性降解ι-卡拉胶能力。经过对菌株KL-A的16SrDNA测序鉴定,将其归属为Cellulophagasp.,命名为Cellulophagasp.KL-A。为了评价菌株的应用潜力,通过对菌株发酵液酶活的测定,响应面实验优化发酵产酶培养基,以提高菌株产酶能力。通过前期一些单因素的实验,结合相关参考文献中海洋细菌的发酵培养基成分,采用统计学响应面优化的方法找到能提高菌株发酵液酶活的最适培养基组成。得出最后优化的培养基中对产ι-卡拉胶酶影响最大的三个因素ι-carrageenan,glucose和CaCl2浓度分别是1.05g/L,14.73g/L和1.35g/L。最优培养基配方如下：1.05g/Lι-卡拉胶,14.73g/L葡萄糖,1.35g/LCaCl2,10g/L酵母粉,0.15g/L柠檬酸铁,4g/LMgSO4,0.06g/LSrCl2,0.06g/LK2HPO4。优化后,菌株KL-A生长的第72小时单位干重酶活达到最大值925.2U/gCDW,是在基础培养基中最大酶活值的20.6倍,是优化碳氮源后的酶活值的9.6倍。同时,菌株在优化培养基中菌体干重是基础培养基中的2.4倍。本文是首次对Cellulophaga属细菌通过响应面优化培养基提高ι-卡拉胶酶产量,且产酶能力显著提高。通过微生物全基因组测序,从Cellulophagasp.KL-A基因组全序列中初步发现卡拉胶酶,琼胶酶基因相关的8个ORF,但没有发现琼胶酶活性,鉴于前期实验中菌株高效的降解ι-卡拉胶,所以对其ORF的序列中的两个ι-carrageenase基因克隆表达,并对其酶学性质和降解产物进行了研究。克隆得到的CgiA2_Ce基因序列全长1476bp,编码一个由491个aa残基组成的蛋白CgiA2_Ce。在线预测蛋白分子量大小为53.55kD,预测等电点为9.46。使用pET-32a(+)载体构建了CgiA2_Ce表达载体,重组质粒转入E.coliBL21(DE3)表达宿主菌中,成功构建重组工程菌,镍柱亲和层析纯化,得到ι-卡拉胶重组酶CgiA2_Ce。对ι-卡拉胶重组酶CgiA2_Ce的底物特异性的研究发现,重组酶CgiA2_Ce只能够专一性的降解ι-卡拉胶。该酶的最适反应温度为40℃,在37-43℃之间酶的相对活性保持在80%以上,在温度40℃或以下,放置1h,仍然能够保留其最大活力的80%以上。最适反应缓冲液体系为Tris-HClbufferpH7.5。且重组酶展现了较广的pH耐受性,pH6.5-8.0范围内能保持最大活性的70%以上。金属离子K+和Mg2+对酶活力有轻微促进作用,而Na+和Ca2+有明显促进作用(34%-57%)。根据双倒数作图法对米氏常数的测定,得出当以ι-卡拉胶为底物时,得到的Km和Vmax值分别为0.93mg/mL和573.5U/mg。较小的米氏常数值Km和较大的Vmax值验证了ι-卡拉胶是重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce较好的动力学反应底物。通过薄层色谱及质谱对水解产物进行分析,发现重组ι-卡拉胶酶CgiA2_Ce为内切酶,ι-卡拉胶最终水解产物主要为卡拉胶二糖和四糖。目前研究的所有卡拉胶降解酶都是以内切的方式降解卡拉胶。内切卡拉胶降解酶将大分子量的卡拉胶降解为低粘度的小分子量的寡糖。通过摸索加入酶的量以及对酶解反应时间进行控制为取得一些高聚合度的寡糖和低聚和度、单一的寡糖提供了可能。
【作者】古铮；
【导师】邵宗泽；单大鹏；
【作者基本信息】厦门大学，动物学，2014，硕士
【关键词】Cellulophagasp.KL-A；卡拉胶；ι-卡拉胶酶；ι-卡拉胶寡糖；响应面优化；

【参考文献】
[1]陈亨友.数据分类中决策树算法的研究[J].软件导刊,2005,13:27-29.
[2]江敏.BTA深孔钻杆系统的涡动及压电控制研究[D].中北大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[3]陈普然.基于嵌入式MPU核的1553B总线接口控制器的设计[D].南京航空航天大学,通信与信息系统,2003,硕士.
[4]谢桦,孟顺.基于指数平滑法的平抑风电功率波动储能控制策略[J].北京交通大学学报,2014,05:123-127.
[5]储慧.基于AHP分析法的新型农民培训模式比较研究[D].南京农业大学,农业推广,2012,硕士.
[6]张建刚,毛剑琴,夏天,魏可惠.模糊树模型及其在复杂系统辨识中的应用[J].自动化学报,2000,03:378-381.
[7]申茂欣.禽流感病毒Re-4株的纯化、筛选和疫苗生产工艺研究[D].扬州大学,预防兽医学,2011,硕士.
[8]张楠.S集团预算管控问题研究[D].吉林大学,会计,2013,硕士.
[9]占先运.基于数据仓库的电信业决策支持系统[J].湖南科技学院学报,2005,05:185-188.
[10]曾红.我国老年保健品营销策略研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[11]王永胜.呼和浩特地区高职院校师资队伍建设现状及对策研究[D].内蒙古师范大学,教育管理（专业学位）,2013,硕士.
[12]杨云裳,张彬,张应鹏.氧化石墨烯的制备及在复合材料中的应用研究进展[J].应用化工,2013,06:1138-1141.
[13]程代来.交通高职化学校本课程开发研究[D].湖南师范大学,教育,2003,硕士.
[14]吴山.Zn-Mn复合金属氧化物的制备与结构、光学和磁学性质的研究[D].湖北大学,光学,2011,硕士.
[15]邵敏斯.基于智能天线的认知无线电网络频谱共享技术研究[D].湖南大学,电子科学与技术,2012,硕士.
[16]李磊.城市轨道交通BT工程项目风险管理研究[D].北京交通大学,2009.
[17]王玮,王军,由大德.基于遗传算法的海上舰艇编队配置方法研究[J].控制与决策,2003,06:736-739.
[18]杨丽娜.《城市的崛起—城市系统学与中国城市化》第九章翻译报告[D].内蒙古大学,翻译,2014,硕士.
[19]胡艳.ARFI技术评价肌肉损伤后组织修复动态变化的实验研究[D].辽宁医学院,影像医学与核医学,2012,硕士.
[20]李超.膜生物反应器对微污染物NH_3-N和HA的处理效果研究[D].广东工业大学,市政工程,2014,硕士.
[21]祝坤.网络谣言入罪与网络谣言治理[D].苏州大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[22]宋桂才.论日本式经营及其未来走向[D].吉林大学,世界经济,2004,硕士.
[23]王媛媛.高动态GNSS接收机的电路设计和实现[D].北京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[24]平云.甲酸水解制氢用高性能催化剂Ag_(0.1)Pd_(0.9)/rGO与Ag_(0.2)Au_(0.4)Pd_(0.4)/rGO的制备与研究[D].吉林大学,2014.
[25]肖亦凡.咨询服务企业新运营模式下的CRM系统应用研究[D].西南交通大学,工业工程,2014,硕士.
[26]卢整智.几类随机压缩型算子及其随机不动点理论[D].西北师范大学,基础数学,2013,硕士.
[27]张雪霞.油田通信专业业务培训考试系统设计与实现[D].西安科技大学,计算机技术,2014,硕士.
[28]陈德祥.江泽民发展邓小平经济伦理思想研究[D].华中师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[29]缪苗.物流快递企业质量控制对客户稳定体系的影响研究[D].浙江大学,2006.
[30]左翼.警察心理韧性量表的编制[D].西南大学,基础心理学,2013,硕士.
[31]石晶1,王冠一1,李刚1,王铁超1,赵志强2.基于CarSim的线控转向汽车建模与仿真研究[J].辽宁工业大学学报(自然科学版),2015,01:.
[32]子华明.大学生吸烟行为影响因素分析与干预对策研究[D].华东师范大学,应用心理学,2013,硕士.
[33]陈玥衣.思想政治教育的社会管理功能研究[D].北京交通大学,2014.
[34]赵雪,邱平达,姜海静,金振兴,蔡克迪.超级电容器电极材料研究最新进展[J].电子元件与材料,2015,01:1-8.
[35]张子振,杨慧中.具有修正的Lelie-Gower项Holling-Ⅲ类时滞捕食系统的Hopf分支(英文)[J].自动化学报,2013,05:610-616.
[36]郜鹏云.复方姬松茸多糖口服液的安全性和药理药效学研究[D].天津农学院,预防兽医学,2014,硕士.
[37]邓路平.基于Steerable滤波器的指纹图像增强算法及增强系统FPGA实现[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[38]毛小平,吴蓉元,曲赞.频率域位场下延的振荡机制及消除方法[J].石油地球物理勘探,1998,02:230-237+284.
[39]张琳.当代中国粮食安全问题研究[D].吉林大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[40]张云鹏.焦化废水中氨氮的去除效果及影响因素研究[D].西安建筑科技大学,市政工程,2013,硕士.
[41]姜长生,吴庆宪,王丕宏.系统主导特征向量配正设计的稳定性分析[J].自动化学报,1999,06:750-756.
[42]苗笛.B2C网站的信息设计优化研究[D].东北师范大学,设计艺术学,2012,硕士.
[43]郭彦余.深空探测任务小推力转移轨道设计与优化方法研究[D].哈尔滨工业大学,航天工程,2013,硕士.
[44]马士龙.物化—生化组合工艺处理不同来源乳化液废水研究[D].华东师范大学,环境工程,2013,硕士.
[45]靳培培.电子政务公开下的个人信息保护[D].郑州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[46]陆强.转型视角下中国国有企业治理法律研究[D].山东财经大学,民商法学,2014,硕士.
[47]杨旭.我国农村村民自治现存的问题与对策[D].长春工业大学,行政管理,2013,硕士.
[48]贾晓静.FP2500A型翻抛机主要零部件的有限元分析[D].南京农业大学,农业机械化工程,2012,硕士.
[49]韩聪颖.小型天文卫星高精度姿态确定和控制技术研究[D].西北工业大学,导航、制导与控制,2004,硕士.
[50]刘纯.基于MVC设计模式的Struts技术在B/S系统中的研究与应用[D].西安建筑科技大学,计算机应用技术,2004,硕士.