海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分离纯化与特性研究

【摘要】植物致病真菌是造成主要粮食和经济作物减产的头号杀手,目前大量使用的化学农药已经对环境和人类健康造成了巨大的负面影响。同时开发新型化学农药的高成本及耐药微生物的迅速出现等因素,引起我们对生物农药的关注。其中,抗真菌蛋白因其来源广泛及其独特的作用机制,为新型抗真菌活性物质的研究提供了重要信息,并成为了研究热点。此外,陆地生物资源已被大量开发,发现新型抗菌物质的可能性不断下降,迫切需要寻找新的来源。海洋提供了非常特殊的生态环境,使海洋微生物能够进化出特殊的代谢途径,产生更多新型的抗菌活性物质,将在植物病原菌治理及活性物质开发方面发挥重要作用,因此,从海洋微生物中分离抗真菌蛋白具有重要的研究意义。为了从海洋中寻找具有高效抗菌活性的天然产物,本研究首先采用平板稀释法和平板扩散法从深海中筛选活性菌株。通过使用不同配方的培养基,对采集自各种海洋环境(大洋、北极和南极)的深海样品进行微生物菌株的分离筛选,筛选到了300余株真菌以及大量的细菌,其中包括了许多具有抗菌活性的微生物。接着以7株植物病原真菌和7株致病细菌为指示菌进一步筛选并鉴定出具有高效抗菌活性的菌株,植物病原真菌包括宛氏拟青霉、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、绿色木霉、立枯丝核菌、长柄链格孢和核盘菌,致病细菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气假单胞菌和黄单胞菌。本研究共分离到57株具有抗植物病原菌活性的菌株,包括53株活性真菌和4株细菌,分别鉴定种属并统计活性情况和样品来源,为研究海洋抗菌微生物资源以及开发新型抗菌活性物质奠定了良好的基础。更重要的是,本研究从西南印度洋底泥样品中分离并鉴定出一株桔青霉,命名为W1。该菌株的发酵上清对多株植物病原菌具有拮抗活性,并通过采用盐析、透析、冻干、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、超滤浓缩等方法,最终从海洋桔青霉W1发酵液上清中分离纯化到一种抗真菌蛋白,将它命名为PcPAF。SDS-PAGE电泳结果表明,PcPAF的分子量大小约为10kDa。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定以及N端测序分析该蛋白的序列,根据分析结果判断PcPAF可能为一种新的抗真菌蛋白,并检测了该抗真菌蛋白的理化性质。结果表明PcPAF对4株植物病原菌真菌,绿色木霉、宛氏拟青霉、长柄链格孢和胶孢炭疽菌具有较强的抑制活性,纸片法检测PcPAF对绿色木霉、尖孢镰刀菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢的最低抑制浓度分别为1.52μg/disc、6.08μg/disc、3.04μg/disc和6.08μg/disc.PcPAF在80℃条件下处理20min其活性不受影响；能够耐受多种金属离子处理,经过20mM的Mn2+处理后,能保持75%的抗菌活性；可以耐受酸性环境,并在弱酸环境中显示出最好的抗菌活性；此外,PcPAF对紫外辐射,多种有机溶剂、表面活性剂以及蛋白酶都有较好的耐受能力,在一般条件下都能保持较好的抗菌活性。PcPAF与已经报道的真菌来源的抗真菌蛋白在序列和性质上都存在一定差异,可能是一种新的真菌来源的抗真菌蛋白。通过在发酵培养基中加入甘氨酸能够明显挺高海洋桔青霉W1发酵上清的抗菌活性,抗菌活性提高约62%。此外,PcPAF在盆栽试验中都表现出较好的抗病效果,其中对小麦赤霉病的防效达到了52%。总之,本研究发现了一种抗真菌蛋白并命名为PcPAF,该蛋白具有较好的抗真菌活性和较广泛的抗菌谱,对外界环境具有较好的耐受力,通过添加营养源提高了发酵产物的抗菌活性,并在实际应用中具有一定的抗病效果,具有作为生物农药的潜在能力,为抗真菌蛋白PcPAF在作物抗真菌感染方面的应用奠定了基础。
【作者】文超；
【导师】徐洵；陈新华；
【作者基本信息】厦门大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】海洋微生物；植物致病真菌；抗真菌蛋白；PcPAF；

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