Caspase在细胞凋亡过程中切割ARF-BP1蛋白的研究

【摘要】ARF-BP1(又称Mule、Huwe1、HectH9等)是一个含HECT结构域的E3泛素连接酶,其底物包括许多重要的细胞功能调控蛋白,例如肿瘤抑制因子p53、抗凋亡蛋白Mcl-1、负责DNA复制的Cdc6、与神经干细胞分化相关的N-Myc、以及c-Myc、Miz-1、TopBP1、Dv1等。ARF-BP1通过泛素化降解调控这些重要蛋白的功能,因此在细胞生长增殖、DNA损伤应答信号转导、细胞凋亡及肿瘤发生中发挥重要作用。细胞凋亡是当细胞受到DNA损伤等细胞胁迫时发生的细胞程序性死亡过程。Caspase家族在细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。细胞凋亡一般通过两条经典途径激活,即由细胞表面死亡受体引发的外源细胞凋亡途径和内源性线粒体细胞凋亡途径。另外还包括一条内质网介导的细胞凋亡途径。这些途径导致了起始caspase的活化,活化的起始caspases然后切割执行caspase,执行caspases进一步切割下游底物,最终导致细胞发生不可逆的死亡。之前对caspase家族底物数据库的研究发现,涉及在单一生化途径或某一大分子复合物中的许多蛋白都会被切割。而与ARF-BP1相互作用的p53、Mcl-1、Cdc6等在细胞凋亡时都会被caspase切割,因此,我们进行了caspase是否在细胞凋亡情况下调节ARF-BP1功能的研究。我们首先利用UV诱导Hela细胞发生凋亡,发现了ARF-BP1的切割现象。这种切割是UV剂量和时间依赖性的。只有在用引发细胞发生凋亡的剂量照射时才会发生ARF-BP1的切割,这种切割随着时间的延长会愈加明显。同时ARF-BP1的切割并不受特定细胞系或特定凋亡刺激的限制。因为我们在Hela细胞,Jurkat细胞和SW620细胞中以及用UV和其它DNA损伤刺激时均观察到了ARF-BP1的切割现象。随后我们用caspase广谱抑制剂Z-VAD-fmk处理UV照射的Hela细胞,与用DMSO处理的对照组相比,ARF-BP1的切割被明显抑制。同时UV照射引起的Hela细胞凋亡也被显著抑制,说明细胞凋亡时ARF-BP1的切割是caspase引起的。而蛋白酶体抑制剂MG132则无此作用。为了鉴定ARF-BP1上的caspase切割位点,我们将ARF-BP1的不同片段转染Hela细胞,UV照射诱导细胞凋亡后观察各片段的切割情况,发现ARF-BP1的1-1300aa和2000-2500aa这两个片段在UV处理后出现了特异切割的条带,并伴随降解。我们随后进行了一系列点突变实验,发现ARF-BP1在1193位点和2473位点处的天冬氨酸被切割。体外切割实验表明caspase-3/-6/-7均能切割ARF-BP1,并进一步验证了1193和2473位点为切割位点。这些发现使我们对ARF-BP1功能的调控机制有了一个新的认识。
【作者】安涛；
【导师】张四清；
【作者基本信息】厦门大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】凋亡；Caspase；ARF-BP1；

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