鲍病原菌的分离、鉴定及微生物群落动态变化与病害相关性研究

【摘要】鲍是重要的经济贝类。从上世纪60年代起,主要产鲍国家开始探索人工养殖的方法。然而随着养殖规模不断扩大、密集养殖程度加剧,致使各种病害频繁发生,成为鲍养殖业发展的重要制约因素。病原微生物被认为是导致养殖鲍高死亡率的重要原因之一。本文利用传统培养方法、病原菌分子鉴定及理化分析、微生物分子生态学技术和高通量测序等方法,探析了养殖鲍病害爆发过程中主导细菌的类型及特性,比较分析了健康样品和病害样品的微生物群落多样性和结构组成的差异等内容。主要分析结果如下：1、从采集于2009年至2011年的杂色鲍(Haliotisdiversicolor)病鲍中分离出一株具有强致病性的优势菌AP37。在106CFU/mL的浓度下的浸泡感染实验表明,杂色鲍在水温为20℃、24℃和28℃的条件下的死亡率分别为0%、53%和67%。肌肉注射实验也表明菌株AP37的半致死浓度LDso较低,为2.9×102CFU/g。对胞外产物等毒性相关因子的进一步分析表明,菌株AP37具有鞭毛,能够产生脂肪酶、磷脂酶和溶血素等多种与致病性相关的胞外产物。看家基因rpoD、rctB、gyrB、toxR及pyrH的多位点联合分析将菌株AP37鉴定为Vibrioharveyi。药敏性实验表明,菌株AP37对7种常见抗生素敏感而对13种抗生素具有抗药性。2、综合运用传统培养方法和末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)的方法,探究微生物与皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)稚鲍病害之间的关系。培养结果表明正常池的健康稚鲍样品(HA)的菌落(CFUs)数量最高,其中Nesterenkoniasandarakina为优势菌株；病害池濒死稚鲍样品(DM)的细菌种类较为丰富,Vibrio为优势菌群,所占比例为93.8%；然而病害池的健康样品(DA)的菌落数量最低；从健康池濒死鲍样品(HM)、DA和DM中均可分离获得分子鉴定为Vibrioatlanticus的菌株,且其在这些样品中占有较大比例。T-RFLP方法对样品微生物多样性的分析与培养结果一致,并且发现片段504bp出现在样品HM、DA和DM中且占有较大比例,能够产生504bp的菌株多数为弧菌属,504bp可能是重要的与病害相关的指示片段。鉴定为V.atlanticus的菌株同样能够产生504bp,表明其与鲍病害发生紧密相关。3、使用MiSeq高通量测序技术比较不同生存状态的杂色鲍肠道、肝胰腺及相应水样的微生物组成和差异,结果表明支原体(Mycoplasma)广泛分布于肠道、肝胰腺和养殖水环境,是肠道样品中的优势菌群,且在肠道cDNA样品中,Mycoplasma在健康样品中的比例小于濒死样品中的比例,说明Mycoplasma是杂色鲍体内及养殖环境中稳定存在的菌群,且可能是潜在致病菌；嗜冷菌属Psychrilyobacter在健康鲍肠道样品(AH、ah)中的比例明显大于在活力降低和濒死鲍样品(AD、ad、AM)中的比例,并且在cDNA文库中的差异更明显；而Prolixibacter在样品AM中的比例明显大于其他样品；弧菌(Vibrio)在健康样品中的比例比病鲍样品和濒死鲍样品中的比例高,并且在肠道cDNA样品中的比例高于相对应的DNA样品中的比例。另一方面,肝胰腺样品中存在着与肠道、及环境样品截然不同的微生物组成。δ-Proteobacteria是肝胰腺样品中的主导菌群,且其中海洋细菌SAR324类群存在于各个生存状态的肝胰腺样品中。
【作者】侍浏洋；
【导师】赵晶；
【作者基本信息】厦门大学，海洋生物技术，2014，硕士
【关键词】养殖鲍；病害；病原微生物鉴定；微生物多样性分析；高通量测序；

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