病原微生物的基于熔解曲线的最小化多位点序列分型

【摘要】病原微生物引起的传染性疾病是全球公共卫生领域面临的严峻课题。通过病原微生物分型,可实现对病原微生物的流行病学调查、跟踪和阻断传播途径以遏制其暴发流行。理想的病原微生物分子分型技术,应具有分型能力强、操作简便、重复性好、准确快速、高通量自动化、成本低廉的特点。本论文以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为模型,建立了一种新型的数字化病原微生物分子分型技术-基于熔解曲线的最小化多位点序列分型(minimMcMLST)。第一章,阐述了病原微生物分型的意义。探讨了目前病原微生物分型技术的研究现状,重点介绍和比较了各种核酸指纹分型技术的优缺点,总结了一个理想分型技术应具备的特点。最后,在多位点序列分型技术(MLST)和多色熔解曲线分析(MMCA)的基础上,提出了minimMcMLST方法,本方法可利用MLST序列型(STs)中最少的单核苷酸多态性(SNPs)位点达到病原微生物分型的目的。第二章,首先详细的阐述了minimMcMLST方法的分型原理。然后以沙门氏菌为模型,对minimMcMLST技术的可行性进行了初步的研究,建立了双反应三重荧光PCR的沙门氏菌分型体系。利用MinimumSNPs软件对1560个STs进行分析,共筛选出6个具有显著分型能力的SNPs位点,另外,人工添加了1个SNP位点,用于区分中国最流行的两种STs。理论上,这7个位点可将1560个STs分成了59种熔解类型(MTs)。本体系的特异性高,重复性好,检测下限可达到5copies/反应。对167份标本进行检测,共发现17种MTs。测序验证了52份代表菌株,分析显示,探针覆盖区与测序结果完全一致。利用PHYLIP软件的非加权组平均法(UPGMA)对52份标本构建了系统发育树,直观显示出,本方法获得了17种MTs,而MLST方法获得了23种STs。相对于MLST方法,计算出本方法的Simpson’sindexofdiversity(D)等于0.9818。第三章,在上述基础上通过进一步增加SNPs位点的选择,探讨提高minimMcMLST分辨率的途径。我们以金黄色葡萄球菌为模型,建立了三管三重的金黄色葡萄球菌分型体系。该体系所检测的SNPs位点增至15个,理论上可将2151个序列型分成288种MTs。实验检测了376份标本,获得29种MTs。测序验证的70份代表菌株显示,探针覆盖区与测序结果完全一致。利用PHYLIP的UPGMA算法构建了系统发育树,结果表明,本方法获得了24种MTs,而MLST方法获得了29种STs。相对于MLST方法,计算出D值为0.9884。进一步利用goeBURST-1.2.1对70份菌株进行了克隆谱系分析,我们的方法未区分的菌株在MLST中均被划分到了相同的克隆群中,其溯源分析能力与MLST开始趋于一致。标本的分型正确率为97.19%。最后,通过对376标本的耐药状态检测,我们观察到熔解类型与菌株的甲氧西林耐药性表现出明显的相关性,因此,基因分型对临床用药具有潜在的指导价值。
【作者】孙利；
【导师】李庆阁；
【作者基本信息】厦门大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】基于熔解曲线的最小化多位点序列分型；单核苷酸多态性；沙门氏菌；金黄色葡萄球菌；D值；

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