SLC25A38基因在急性淋巴细胞白血病细胞中的表达及其功能的初步研究

【摘要】目的：急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一类造血干细胞来源的恶性克隆性疾病,近年来,靶向杀伤治疗已成为ALL治疗的发展趋势,分析ALL发生机制、寻找新的治疗靶点成为研究热点。溶质转运蛋白家族(solutecarrier,SLC)是细胞内最大的一类转运蛋白家族,主要功能是介导线粒体基质与膜间隙或膜间隙与细胞质之间的溶质转运,为线粒体提供正常运转所需的物质保障。SLC25A38基因定位于染色体3p22,是一种氨基酸载体,初步研究结果证实,SLC25A38蛋白与神经细胞的凋亡和退行有密切联系,在造血器官(胚鼠肝脏和骨髓)中大量表达,可能与造血细胞的增殖分化有关。为了探讨SLC25A38基因对白血病细胞增殖、分化的影响,分析其与ALL患者临床特征的关系,我们设计了本实验。方法：1.收集55例初治急性淋巴细胞白血病患者(其中儿童23例、成人32例)做为实验组,20例非恶性血液病患者(其中儿童10例,成人10例)做为对照组。通过实时荧光定量RT-PCR及Westernblot方法检测SLC25A38基因在mRNA和蛋白表达水平的变化。分析SLC25A38蛋白表达与ALL患者初诊时临床特征、化疗反应和疗效之间的关系。对部分成人SLC25A38蛋白表达阳性患者进行随访,检测不同疾病状态下SLC25A38蛋白表达水平的变化。2.用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基体外培养骨髓瘤细胞株(RPMI8226及U266细胞)和白血病细胞株(K562、MOLT-4及Jurkat细胞)。通过Westernblot方法检测SLC25A38蛋白在各细胞株的表达水平,同时检测Notchl蛋白在各细胞株和成人ALL患者中的表达水平。3.以高表达SLC25A38蛋白的Jurkat细胞为模型,构建针对SLC25A38基因的shRNA,转染Jurkat细胞并经G418筛选出稳定转染株。实验分4组：SLC25A38-shRNAl组(Sh1组)、SLC25A38-shRNA2组(Sh2组)、scramble-shRNA组(NC组)和Jurkat空白对照组(Ctrl组)。Westernblot和实时定量RT-PCR检测各组细胞SLC25A38蛋白和mRNA的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况；给予不同浓度阿霉素作用后,流式细胞术检测各组不同浓度阿霉素作用下细胞凋亡情况变化。结果：1.SLC25A38基因在ALL细胞中的表达：mRNA水平分组中,将对照组mRNA相对表达量设定为1。儿童组中<1组ALL患儿SLC25A28mRNA的相对表达量为0.2659±0.2874,>1组的相对表达量为3.1418±1.0607,两组SLC25A38mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P<0.0001)。成人组中<1组ALL患者SLC25A28mRNA的相对表达量为0.3200±0.3382,>1组的相对表达量为1.6707±0.6094,两组SLC25A38mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P=0.0003)。蛋白水平分组中,儿童ALL组SLC25A38蛋白阳性率34.78%(8/23)；成人组蛋白阳性率46.9%(15/32)；20例对照组均未检测到SLC25A38蛋白表达。2.临床特征、治疗反应和疗效：mRNA水平分组中,儿童及成人小于对照组(<1组)与大于对照组(>1组)两组患者在性别、年龄、免疫分型、初诊时外周血白细胞数、血红蛋白量、血小板、骨髓原始细胞数等临床特征之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。蛋白水平分组中,儿童ALL组SLC25A38蛋白表达阳性组与阴性组在性别、免疫分型、初诊时外周血白细胞数、乳酸脱氢酶之间差异具有统计学意义(P<0.05),而两组在年龄、初诊时外周血血红蛋白数、血小板、骨髓原始细胞数、初诊时肝脾大、出血、淋巴结肿大、初诊时CNSL/TL、泼尼松反应、完全缓解率与复发率之间的差别没有统计学意义(P>0.05)；成人ALL组SLC25A38蛋白表达阳性组较阴性组初诊时外周血白细胞数升高(P<0.05),而两组在性别、免疫分型、初诊时外周血血红蛋白数、血小板、骨髓原始细胞数之间的差别没有统计学意义(P>0.05)。3.蛋白水平与肿瘤负荷：随访观察2例SLC25A38蛋白阳性的成人ALL患者发现,给予联合化疗达血液学缓解后,其SLC25A38蛋白表达水平明显下降甚至消失,而疾病复发时再次出现,且其表达水平与复发时骨髓原始细胞比例呈正相关性。4.白血病细胞株中SLC25A38蛋白的表达：5种骨髓瘤或白血病细胞株均表达SLC25A38蛋白,其中以Jurkat细胞表达量最高。5.对Notch蛋白表达的影响：对各骨髓瘤或白血病细胞株及成人ALL样本同时检测Notchl蛋白发现,SLC25A38蛋白与Notchl蛋白在各细胞株及成人ALL样本中均存在共同表达。6.SLC25A38基因沉默对白血病细胞增殖的影响：MTT结果表明,Sh1组和Sh2组细胞的OD490值明显高于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义沉默SLC25A38基因后Jurkat细胞的增殖加快。7.SLC25A38基因沉默对白血病细胞周期影响：流式细胞仪检测细胞周期结果表明,Sh1组和Sh2组细胞G0/G1期比例减少,S期与G2/M期比例增加,表明基因沉默后Jurkat细胞生长加快。8.SLC25A38基因沉默对白血病细胞凋亡影响：SLC25A38基因沉默后,各组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)；给予不同浓度阿霉素作用后,Shl组和Sh2组细胞只比对照组细胞凋亡率有所上升,但差异无统计学意义(P>O.05)。结论：1.SLC25A38基因异常表达在儿童和成人ALL中是一种普遍的现象,但mRNA表达与蛋白表达水平不一致。2.SLC25A38蛋白高表达与ALL患者外周血白细胞数等临床特征相关,且与ALL肿瘤负荷有关。3.通过shRNA技术成功靶向沉默SLC25A38基因可以促进Jurkat白血病细胞增殖,对细胞凋亡过程无显著影响。4.沉默SLC25A38基因不影响Jurkat白血病细胞对阿霉素的化疗敏感性。5.SLC25A38基因在白血病细胞增殖调解中发挥抑癌基因作用。
【作者】陈华英；
【导师】鹿全意；
【作者基本信息】厦门大学，内科学，2014，硕士
【关键词】白血病；急性；SLC25A38基因；基因表达；基因沉默；

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