HPV16E6肺癌细胞模型的构建及HPV16E6抗原特异性树突状细胞的培养

【摘要】背景与目的：肺癌是当今世界上发病率和死亡率增长最快,对人类威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌的发病机制比较复杂,吸烟被认为是肺癌发病的主要原因。自从Syrjanen(1)首次提出人乳头瘤病毒感染可能与肺癌的发生发展有关后,许多研究表明了HPV感染与肺癌的相关性。进一步研究发现,HPVE6/E7蛋白对于促进肺上皮细胞的增生和致瘤性具有重要的作用。人乳头瘤病毒E6蛋白(HPVE6)是由151个氨基酸残基构成,分子量为19000,含有2个锌指结构,每个锌指结构含有2个C-X-X-C序列,具有抗原性(2)。我们的前期研究发现,在肺癌患者中约有52%的患者可以检测到HPV16E6蛋白抗原,主要分布在肺癌细胞的胞浆和核膜。同时我们发现,具有HPVE6蛋白抗原表达的肺癌组织周围浸润淋巴细胞明显增多。国外研究也发现(3),在HPV16阳性的肺癌患者中,表达E6蛋白的患者,尤其是11-20位表达显著者,常常有T细胞反应性增多的现象。因此我们认为,HPV16E6蛋白可能是肺癌患者中一个较普遍存在的特异性肿瘤抗原,用HPV16E6抗原特异性T淋巴细胞进行过继免疫治疗,可能会在HPV16E6阳性的肺癌患者身上取得令人鼓舞的效果,从而改变目前肺癌特异性淋巴细胞过继治疗的困境。树突状细胞是机体功能最强大的抗原递呈细胞,并能诱导机体产生抗原特异性细胞毒T淋巴细胞反应(cytotoxicTlymphocyte,CTL反应),在机体抗肿瘤免疫治疗中具有重要作用。研究表明(4),肿瘤相关抗原致敏的DC可对T细胞产生强大的诱导功能,通过在体外培养DC,并用肿瘤裂解物、凋亡的肿瘤细胞致敏DC并回输体内,到诱导机体产生特异性的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞,共同发挥抗肿瘤免疫应答作用。脐血、骨髓及外周血是人树突状细胞培养的主要来源,临床上多数采用外周血单个核细胞来源的DC,其产量大,纯度高并且容易获得。通过提取患者外周血单个核细胞,经培养成DC并致敏后回输患者体内进行抗肿瘤治疗,已经取得一定的疗效。最早的树突状细胞主要来源于骨髓造血干细胞,后期研究者发现(5),外周血单个核细胞在细胞因子GM-CSF和IL-4的诱导下,经过培养也可获得未成熟DC,同时在肿瘤抗原或肿瘤坏死因子(TNF-a)的刺激下进一步发育成熟,从而获得成熟DC。本研究主要在于构建HPV16E6肺癌细胞模型,并验证肿瘤抗原特异性树突状细胞的特异性刺激效果,为后期验证肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的疗效及在动物模型中的治疗效果奠定基础。实验方法：1.人工合成HPV16E6基因,将HPV16E6基因连接到pEGFP-Nl质粒载体上,构建能够表达绿色荧光的重组质粒,并重新提取和检测重组质粒DNA。2.将表达HPV16E6基因的重组质粒用慢病毒包被,并用该上清感染H1299肺癌细胞,构建HPV16E6肺癌细胞模型。3.提取外周血单个核细胞,经培养、肿瘤抗原刺激,验证肿瘤抗原特异性树突状细胞的特异性刺激效果。实验结果：1.成功构建了含HPV16E6基因的重组质粒载体,经质粒双酶切和PCR扩增后,得到了大小约为500bp的基因片段。2.将慢病毒包被含HPV16E6基因的质粒载体,并成功感染了H1299肺癌细胞,构建成功HPV16E6肺癌细胞模型。经提取细胞RNA,逆转录和RT-PCR后,成功验证了HPV16E6基因在H1299肺癌细胞的过表达。3.本实验通过提取外周血单个核细胞,同时加入细胞因子刺激树突状细胞成熟,后期通过流式细胞仪(FCM)检测经肿瘤抗原刺激后的肿瘤特异性树突状细胞与未经肿瘤抗原刺激的树突状细胞的表型。前者的细胞表型CD80、CD86表达量较高,细胞成熟度较高。本实验表明经HPV16E6抗原刺激能够促进DCs进一步成熟,为制备HPV16E6特异性T淋巴细胞奠定基础。
【作者】邓伟先；
【导师】江兴堂；
【作者基本信息】厦门大学，内科学，2014，硕士
【关键词】HPV16E6；肺癌细胞；树突状细胞；

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