T-钙粘蛋白对恶性黑色素瘤增殖和侵袭力的影响

【摘要】恶性黑色素瘤起源于黑素细胞,是皮肤癌中侵袭性最强的类型,其最突出的特点是对放化疗的不敏感以及外部刺激可促进肿瘤的进展和转移。全世界恶性黑色素瘤的发病率及病死率不断升高,在美国,每年有近40000恶性黑色素瘤的新发病人,并且有7000人死亡。对于已经发生转移的恶黑仍然没有满意的治疗方法,五年生存率约6%。T-钙粘蛋白与其它已知的钙粘蛋白都不同,它是截短的钙粘蛋白,它的一个独特的特点就是无跨膜区和胞浆区,代之通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositolGPI)锚定在细胞膜上。本课题旨在研究T-cadherin对B16F10细胞生长抑制作用的可能机制,以期为临床基因治疗恶性黑色素瘤提供实验依据。目的：本研究以小鼠黑色素瘤B16F10细胞株为研究对象,采用脂质体转染的方法将T-cadherin转入B16F10细胞系,探讨T-cadherin对B16F10细胞株增殖、凋亡的作用及其机制,探讨T-cadherin对B16F10细胞作用的可能机制,并进一步研究其对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响。方法：1.细胞来源：本实验采用的B16F10细胞是一种来源于C57BL/6小鼠的高转移黑色素瘤细胞系。2.稳定转染细胞系的获得：体外培养黑色素瘤细胞株B16F10,当细胞达到90%融合时,加入真核表达载体pEGFP-N1-T-cadherin与LipofectamineTM2000复合物,用G418进行筛选。3.以B16F10细胞株为研究对象,应用RT-PCR法和免疫组化SP法分别从基因水平和蛋白水平对稳定转染的细胞进行鉴定。4.以B16F10细胞株为研究对象,采用MTT法检测各组细胞的增殖情况,应用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞的周期变化。5.transwell细胞侵袭实验：以B16F10细胞株为研究对象,应用transwell细胞侵袭实验法测定未转染组、pEGFP-N1空载体组和pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的侵袭力。6.数据处理采用SPSS11.5统计学软件进行,采用单因素方差分析和LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1.RT-PCR结果显示扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈明显条带,其大小为208bp。在基因水平证实T-cadherin已成功转染于B16F10细胞。2.免疫组化结果显示未转染组和转染pEGFP-N1空载体组T-cadherin表达均为阴性,转染pEGFP-N1-T-cadherin组呈阳性表达。从蛋白水平证明了T-cadherin已成功转染于B16F10细胞。3.增殖活性检测：pEGFP-N1-T-cadherin组的细胞生长明显受抑。MTT结果显示,pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的OD值为0.383±0.116,远远低于未转染组的1.142±0.053和pEGFP-N1空载体组的1.250±0.055,差异有统计学意义(P<0.05)；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。4.流式细胞仪检测AnnexinV-EGFP/PI染色的细胞凋亡情况：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的早期凋亡率为(28.157±3.692)%,远远高于未转染组的(2.893±0.454)%和pEGFP-N1空载体组的(2.350±0.578)%,差异有统计学意义(P<0.05)；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。5.流式细胞仪通过亚倍体峰检测PI染色的细胞凋亡情况：流式细胞仪检测细胞凋亡最早使用的是PI法,细胞凋亡后形成凋亡小体,导致细胞的DNA丢失,在流式细胞仪检测的DNA含量图中出现亚倍体峰,即凋亡峰。PI染色法结果显示：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组细胞出现了明显的亚二倍体峰,其凋亡率为(16.063±0.795)%,远远高于未转染组的(0.523±0.140)%和pEGFP-N1空载体组的(0.417±0.087)%,差异有统计学意义(P<0.05)；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。6.T-cadherin对恶性黑色素瘤细胞DNA周期的影响：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的G2/M期细胞比率为(10.790±0.731)%；明显高于未转染组的(1.963±1.145)%和pEGFP-N1空载体组的(1.263±0.459)%,差异有统计学意义(P<0.05),细胞被阻滞在G2/M期；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。7.transwell细胞侵袭实验结果：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组的穿膜细胞数为2.2±0.490,明显少于未转染组的16.8±1.39和转染pEGFP-N1空载体组的15.0±1.265,差异有统计学意义(P<0.05)；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。MTT法显示转染pEGFP-N1-T-cadherin组穿膜细胞的OD值为0.124±0.003,明显低于未转染组的0.263±0.006和转染pEGFP-N1空载体组的0.247±0.012,差异有统计学意义(P<0.05),未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.T-cadherin基因通过G2/M期阻滞和诱导细胞凋亡的方式抑制恶性黑色素瘤细胞生长。2.T-cadherin对B16F10细胞的体外侵袭能力有抑制作用。
【作者】陆海涛；
【导师】段昕所；
【作者基本信息】承德医学院，肿瘤学，2011，硕士
【关键词】T-钙粘蛋白；恶性黑色素瘤；基因治疗；增殖；细胞凋亡；细胞周期；侵袭力；

【参考文献】
[1]刘变叶.战略性新兴产业创业投资政策的缺憾及修正[J].中州学刊,2014,11:54-56.
[2]张海鑫.650nm光波段全复合材料波导热光开关研究[D].吉林大学,集成电路工程,2013,硕士.
[3]王妮妮.杭州市卫浴洁具制造工人苯乙烯职业危害状况和二氯乙烷致脂质代谢影响[D].浙江大学,劳动与环境卫生学,2013,硕士.
[4]杨勇.启蒙时代卢梭的宗教观[D].湖南师范大学,世界史,2014,硕士.
[5]王慧.审查起诉阶段适用刑事和解制度研究[D].内蒙古大学,法律,2013,硕士.
[6]于春华.基于数据挖掘技术的医院器材管理决策支持系统[J].医疗卫生装备,2005,10:37-38.
[7]孟凡举.里氏木霉共表达体系的构建及纤维素酶制剂的开发[D].华东理工大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[8]米云辉.从语际翻译中看汉语古典诗歌翻译的抗译性及策略性叛逆[D].武汉理工大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[9]王静怡.高强高导Cu-Cr-Zr合金的热变形行为研究[D].西安建筑科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[10]吴义生,白少布.面向网购的低碳供应链设计模型及其应用分析[J].控制与决策,2015,04:655-662.
[11]方淑苗.服务业员工情绪劳动策略对工作满意度的影响研究[D].安徽大学,企业管理,2014,硕士.
[12]康绍芬.乡镇幼儿园教师主题式研训一体化实施研究[D].内蒙古师范大学,教育管理（专业学位）,2012,硕士.
[13]胡彦辉.垂直深埋U型管大地耦合式地源热泵冬季实验研究与三维数值模拟[D].重庆大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2003,硕士.
[14]毕文毅.迪伦马特侦探作品中的正义观[D].上海外国语大学,德语,2012,硕士.
[15]李明燕.透明曲面成形过程关键位置激光监测系统方案[D].北京邮电大学,物理电子学,2013,硕士.
[16]沈静.Hcy诱导血管平滑肌细胞增殖相关蛋白质的比较蛋白质组学研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,劳动卫生与环境卫生学,2004,硕士.
[17]李明,王智灵,杨晓宇,陈宗海.突变期电力负荷预测方法及其应用[J].电力系统自动化,2006,10:93-96.
[18]张涛.生物信息学中多标签分类问题探索[D].上海大学,系统分析与集成,2014,硕士.
[19]王子熹.角果木提取物对人卵巢癌裸鼠皮下转移瘤的作用研究[D].青岛大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[20]张淮中.基于先验概率的数据约简方法[J].计算机工程与应用,2003,13:125-126.
[21]李彩芬.表面活性剂对碳酸钡形貌控制机理的研究[D].扬州大学,无机化学,2012,硕士.
[22]姜丽丽,鲁雄.石墨烯在太阳能电池中的应用[J].无机材料学报,2012,11:1129-1137.
[23]于小龙.真假石墨烯一场关于神奇材料的资本盛宴[J].中国经济和信息化,2014,13:32-39.
[24]丁爱珍.现代农业园区土地利用模式研究[D].南京农业大学,农村与区域发展,2011,硕士.
[25]邢清华,雷英杰,刘付显.一种按比例分配冲突度的证据推理组合规则[J].控制与决策,2004,12:1387-1390.
[26]徐霞.高中思想政治生态课堂的实现路径研究[D].苏州大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[27]邵卫红.点衍射干涉检测系统光学结构参数优化及误差分析研究[D].浙江大学,光学工程,2014,硕士.
[28]王红锐.智能门禁系统中人脸识别技术的研究[D].武汉理工大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[29]杨婷.牛Angptl3基因组织表达、多态性及其与生长性状关联分析[D].河南农业大学,动物遗传育种与繁殖,2012,硕士.
[30]全琳.西部机场集团母子公司管理控制模式研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[31]张瑞琳.论搜索引擎服务提供者的侵权责任[D].天津大学,经济法学,2013,硕士.
[32]朱占东.我国中医药人才培养与保护的法律保障[D].西北大学,法学（专业学位）,2014,硕士.
[33]王琳.黑龙江省劳动保障监察执法问题实证分析[D].黑龙江大学,法律,2012,硕士.
[34]王雪.语块教学法应用于对外汉语听力研究[D].辽宁大学,汉语国际教育,2012,硕士.
[35]干子阳.应用骨盆正位X片测量髋臼前倾角的相关研究[D].蚌埠医学院,外科学,2013,硕士.
[36]彭越.脑脊液Notch1、DLL1的检测在中枢神经系统感染性疾病中的临床价值[D].郑州大学,神经病学,2013,硕士.
[37]吴成强,张爱国,陈效,边康玲.超声波强化空气吹脱脱氨的机理研究[J].浙江工业大学学报,2013,05:486-489.
[38]王薇佳.在华A公司生产外包下产品协同开发策略研究[D].上海外国语大学,工商管理,2013,硕士.
[39]匡达,胡文彬.石墨烯复合材料的研究进展[J].无机材料学报,2013,03:235-246.
[40]李宝龙.大连市地铁运行后出租车起步里程及起步价的对策研究[D].大连海事大学,物流工程,2013,硕士.
[41]李雯雯.国有工程设计企业薪酬体系优化研究[D].中南林业科技大学,企业管理,2014,硕士.
[42]宫伟瑶.问题金融机构财政救助资金退出机制研究[D].北方工业大学,经济法学,2014,硕士.
[43]王国强,郝寅雷,李宇波,杨建义,江晓清,周强,王明华.电场辅助离子迁移过程中离子迁移深度模型[J].红外与激光工程,2014,03:818-822.
[44]常香云,陈智高.ERP实施和应用过程中的知识管理[J].情报科学,2004,12:1422-1426+1523.
[45]杨婷.基于MapReduce的好友推荐系统的研究与实现[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[46]陈凯.面向密码应用的硬件代码自动生成关键技术研究[D].国防科学技术大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[47]宁维翾.IL-18、VEGF、MMP-2与子宫内膜异位症患者子宫在位内膜的相关研究[D].浙江大学,2004.
[48]刘琳.称谓语在《发展汉语》（精读）中编排情况的考察与分析[D].内蒙古师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2012,硕士.
[49]郭进萍.红十字文化在华传播研究（1874-1949）[D].苏州大学,中国近现代史,2013,硕士.
[50]荆晓远,胡钟山,杨静宇.基于最佳鉴别向量集的多级分类方法[J].控制与决策,1998,S1:104-107.