纳他霉素滴眼剂治疗家兔真菌性角膜炎的药理作用研究

【摘要】引言真菌性角膜炎(fungalkeratitis,FK)是致盲率较高的化脓性角膜病,常常发生于植物性角膜外伤后。近年来,其发病率在我国明显升高,主要与广泛应用广谱抗生素及皮质类固醇激素,或长期配戴角膜接触镜和免疫抑制剂的应用有关,另外由于抗肿瘤药物的广泛应用,器官移植和导管手术的广泛开展及艾滋病的出现和传播,也使得致病性真菌感染的几率增加,因此真菌性角膜炎的发生率逐年升高。由于真菌性角膜炎发病机制尚不清楚且缺乏有效药物,所以治疗棘手,预后差,可引起严重的角膜溃疡,常导致角膜穿孔、眼内炎,甚至角膜盲以及眼球丧失等,因此真菌性角膜炎目前仍是眼科医师乃至全世界眼科领域所面临的一大难题。1978年,由美国爱尔康公司(Alcon)开发的5%纳他霉素混悬液可有效治疗真菌性角膜炎,商品名那特真(Natacyn),经美国FDA批准用于临床,国外早已将纳他霉素作为治疗真菌性角膜炎的一线药物。我国目前也有那特真的广泛应用,但尚无具有自主知识产权的此类产品上市。石药集团最新研制的纳他霉素滴眼剂,观察其治疗兔眼真菌性角膜炎药理作用,为该药物的顺利上市及其在临床的应用提供实验依据。第一部分茄病镰刀菌生长特性及温度对其生长情况的影响目的：探讨不同孵育温度对茄病镰刀菌生长状态的影响,为获得大量孢子寻找最佳方案。方法：茄病镰刀菌按孵育温度不同分6组,A组、B组、C组、D组、E组分别于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃温箱黑暗孵育7d,F组于35℃温箱黑暗孵育3d再于25℃温箱黑暗孵育至7d,在培养24h,3d,5d,7d时分别用游标卡尺测量各组菌落直径,在培养3d,5d,7d时用血平板计数器计数产孢量。结果：在20℃～30℃范围内茄病镰刀菌菌落生长速度随温度升高而增大,在30℃～37℃范围内菌落生长速度随温度升高而减小,F组产孢量最多,为1.025×109CFU/ml,与其他组比较有差异(P＜0.05)。小结：茄病镰刀菌在20℃～37℃范围内均可以生长,30℃较适合茄病镰刀菌菌落生长,35℃温箱孵育3d再于25℃温箱孵育至7d是获得大量孢子而非菌丝的最佳方案。第二部分兔眼真菌性角膜炎模型的建立及病理观察目的：复制兔眼真菌性角膜炎动物模型,并观察其病理学改变。方法：新西兰白兔15只(30只眼),分正常对照组、假手术组、模型组,模型组采用角膜基质注射法注射茄饼镰刀菌菌液建立茄病镰刀菌性角膜炎模型,假手术组注射生理盐水,正常对照组不做任何处理。各组于接种后2d角膜刮片行真菌培养,接种后15d处死家兔,取角膜,PAS染色观察角膜感染真菌情况,HE染色观察角膜组织病理学改变,透射电镜观察角膜超微结构变化。结果：模型组10只兔眼角膜刮片真菌培养均可见典型真菌菌落生长；正常对照组和假手术组均为阴性,与模型组相比有差异(P＜0.05)；模型组PAS染色可见角膜基质层间有菌丝,且呈平行生长；正常对照组和假手术组未见有菌丝。HE染色显示角膜基质细胞排列紊乱,有大量中性粒细胞浸润；正常对照组和假手术组角膜基质细胞排列整齐,未见中性粒细胞浸润。透射电镜结果显示模型组角膜前上皮增生,分层,大空泡形成；正常对照组和假手术组可见角膜细胞周围有大量的胶原原纤维,角膜细胞核一端的细胞质内可见游离的核糖体和少量粗面内质网以及线粒体,结构完整,排列整齐。小结：角膜基质注射法可以成功建立兔眼的真菌性角膜炎模型。第三部分纳他霉素滴眼剂治疗兔眼真菌性角膜炎的药效研究目的：探讨国产纳他霉素滴眼剂对真菌性角膜炎的治疗作用,为其在临床应用提供实验基础。方法：成年健康新西兰白兔30只(60只兔眼),随机分为6组：正常对照组、生理盐水组、真菌性角膜炎(FK)模型组、Natacyn组、纳他霉素组和纳他霉素滴眼剂赋形剂组。每组10只兔眼。角膜基质注射法建立真菌性角膜炎模型。各组动物于造模后第4d、10d、15d、和21d于裂隙灯下观察兔眼溃疡情况并评分,第10d和21d观察兔眼治愈情况,并记录造模后至用药结束各组角膜发生新生血管、虹膜炎、前房积脓、斑翳等合并症的兔眼数。结果：(1)各组动物造模后4d、10d、15d、和21d兔眼溃疡评分：与正常对照组相比,模型组评分显著升高(P＜0.05)；Natacyn组和纳他霉素组与模型组相比评分显著降低(P＜0.05)；纳他霉素组和Natacyn组相比无明显差异(P＞0.05)；生理盐水组和纳他霉素赋形剂组与模型组相比评分无明显差异(P＞0.05)。(2)纳他霉素治疗兔眼真菌性炎症的痊愈情况：与正常对照组比较,模型组于造模后第10d、第21d兔眼痊愈率均明显降低(P＜0.05)。与模型组比较,生理盐水组和赋形剂组无明显差异(P＞0.05)；Natacyn组和纳他霉素组兔眼痊愈率均明显升高(P＜0.05)。与Natacyn组比较,纳他霉素组治愈兔眼数无明显差异(P＜0.05)。(3)纳他霉素治疗兔眼真菌性炎症发生合并症情况：与正常对照组比较,模型组发生新生血管、虹膜炎、前房积脓、斑翳各种合并症的兔眼数均明显增多(P＜0.05)。与模型组比较,纳他霉素组和Natacyn组发生各种合并症的兔眼数均明显减少(P＜0.05)；生理盐水组与赋形剂组发生各种合并症的兔眼数与模型组比较均无明显差异(P＞0.05)。与Natacyn组比较,纳他霉素组发生合并症的兔眼数无明显差异(P＞0.05)。小结：纳他霉素滴眼剂可显著降低真菌性角膜炎兔眼溃疡评分,提高痊愈率,有效预防并发症,纳他霉素滴眼剂对兔眼真菌性角膜炎有显著疗效。第四部分纳他霉素滴眼剂对兔眼的刺激性研究目的：探讨纳他霉素滴眼剂对正常兔眼的刺激性,为纳他霉素滴眼剂在临床安全应用提供实验基础。方法：实验分为4组：生理盐水组、纳他霉素滴眼剂组、纳他霉素滴眼剂赋形剂组、那特真组。每组随机10只兔眼,用药每天(8-10)次,每次1滴,连续应用至第21d,停药后观察2d。采用双盲法用裂隙灯观察兔眼刺激情况并评分。结果：各实验组药物对正常兔眼均无刺激性,与生理盐水组比较,差异均无显著性(P＜0.05)。小结：纳他霉素滴眼剂对兔眼无刺激性,有着良好的发展前景。结论1.茄病镰刀菌在20℃～37℃范围内均可以生长,30℃较适合茄病镰刀菌菌落生长,35℃温箱孵育3d再于25℃温箱孵育至7d是获得大量孢子而非菌丝的最佳方案。2.角膜基质注射法可以成功建立兔眼的真菌性角膜炎模型。3.纳他霉素滴眼剂可显著降低真菌性角膜炎兔眼溃疡评分,提高痊愈率,有效预防并发症,纳他霉素滴眼剂对兔眼真菌性角膜炎有显著疗效。4.纳他霉素滴眼剂对兔眼无刺激性,有着良好的发展前景。
【作者】董贤慧；
【导师】高维娟；
【作者基本信息】承德医学院，病理学与病理生理学，2011，硕士
【关键词】茄病镰刀菌；真菌性角膜炎；纳他霉素；那他真；药理学；刺激性；

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