家蚕BmAGO2蛋白结合RNA的研究

【摘要】Argonaute（AGO）蛋白免疫沉淀法分离和鉴定miRNA靶基因已成为miRNA靶基因的规模化鉴定的重要方法。AGO蛋白是RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的核心催化元件，能够与小RNA结合并且在小RNA的指导下结合靶基因，进步剪切或抑制靶基因的表达。前期研究我们通过免疫共沉淀方法分离了BmAGO2结合RNA中50nt以下的小RNA，高通量测序获得大量不同类型的小RNA，包括miRNA、piRNA、TE-siRNA和未注释小RNA等。这些小RNA可能通过结合BmAGO2蛋白形成类似miRISC复合体后结合靶基因mRNA。因此，本研究通过免疫共沉淀和高通量测序方法解析和鉴定了BmAGO2结合的小RNA潜在靶基因mRNA，为家蚕中BmAGO2结合的小RNA功能研究打下基础。利用重组病毒ie1-vbacmid-BmAGO2感染BmN细胞表达BmAGO2蛋白后，通过免疫共沉淀方法分离BmAGO2及其结合的RNA。将长度大于200nt的RNA进行高通量测序，测序共获得11,528,900条reads。进步分析高通量测序结果获得BmAGO2蛋白结合RNA中mRNA有851条，转座子（Transposableelements，TEs）有1,694条。BmAGO2蛋白结合mRNA的GO富集性分析结果显示，这些mRNA主要参与家蚕细胞的结构组成和细胞发育，分化过程。基于BmAGO2结合的miRNA和mRNA，通过miRanda和RNAhybrid软件进行了miRNA靶标分析，预测了大量miRNA靶基因的结合位点，进步证实个miRNA对应多个靶mRNA，同时个mRNA也可能受多个miRNA调控的miRNA调控通路的特征。对BmAGO2蛋白结合未注释的siRNA和其潜在的降解靶基因mRNA的研究发现，共有115条BmAGO2结合的mRNA存在匹配的BmAGO2结合siRNA，表明侵染杆状病毒的家蚕mRNA的基因表达可能受siRNA通路的调控BmAGO2结合小RNA中存在大量TE来源小RNA，将BmAGO2结合的丰度大于等于50的TEs与这些TE-siRNA进行匹配对比，发现其中有112条TEs能找到其匹配的BmAGO2结合小RNA，且这些小RNA与匹配TE反向互补，推测这些小RNA可能通过与BmAGO2蛋白结合形成RISC来抑制转座子的表达水平，调控转座子的活性，进步维持基因组的稳定性。BmAGO2结合的bm1645转座子丰度远远大于其它结合的TEs，而且其来源的小RNA丰度也远远大于其它TEs来源的小RNA，表明bm1645转座子是TE来源小RNA的生产基地。bm1645产生小RNA的区域并不是随机分布，而是分布在5个主要的区域。其具体功能机制还有待进步研究。我们随机选择了5个表达丰度较高的TEs：Aquila,BmpiggyBac-MER85,bm1456,bm1645和bm1866。利用重组质粒pIEx-1-BmAGO2在BmN细胞中过表达BmAGO2蛋白，经过qRT-PCR检测显示，Aquila和bm1456的转录水平上调，BmpiggyBac-MER85,bm1645和bm1866下调。同时，通过RNAi的方法分别下调BmN细胞中BmAGO2,BmAGO3和BmSIWI转录水平，经过qRT-PCR检测显示，5个TEs的转录水平均有不同程度的上调。AGO蛋白作为RISC的关键组分，其表达量的降低会影响RISC活性。进步证实BmAGO2可能通过与TE-siRNA结合，形成类似RISC的复合体，从而调控TEs的活性。而BmAGO3和BmSIWI可能是通过与TE-piRNA结合形成类似RISC复合体，具体机制还有待进步研究。
【作者】张玉；
【导师】聂作明；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】RISC；BmAGO2结合；RNA；免疫共沉淀；miRNA；靶基因；TEs；

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