一种短小芽孢杆菌分离鉴定及培养条件研究

【摘要】随着工业化的进展，城市生活垃圾已经不仅只包含有机化合物，越来越多的人工合成的化合物也被排放到环境中，有些化合物含有剧毒，有致癌的作用，而且很难自然降解。这些有害的物质随着垃圾渗透液，对周围地下水和土壤造成了严重的污染。治理环境污染已经成为世界各国努力攻克的难题。科学家们治理环境采用的是化学、物理方法结合生物方法来处理污染物。近年来，科学家们针对不同的污染物采用不同的治理方法，其中微生物方法治理环境具有明显的优势。但是由于人们日常生活中基本上不对垃圾进行分类，导致了生活垃圾渗透液中金属离子含量很高，一些降解垃圾的菌株抗性差，处理垃圾效果不明显。因此亟待开发出一种高表达的、抗性强的，且能够降解垃圾渗透液污染物的优良菌株。已经有研究报道短小芽孢杆菌对降解垃圾有很好的效果，且短小芽孢杆菌由于繁殖速度快，能产生稳定的芽孢，抗逆能力强，成为了越来越受瞩目的生防材料之一。短小芽孢杆菌的生长受外部环境的影响，环境不适宜生长的情况下，就会由营养细胞转变为芽孢，处于休眠状态，不能高效快速生长。碳源、氮源和无机盐都会影响菌体的生长。因此需要筛选出满足其生长的最佳碳源、氮源、无机盐及最优生长条件。本研究针对短小芽孢杆菌的16SrRNA基因碱基序列和gyrA、rpoA基因序列设计了6对特异性引物，通过对填埋场垃圾渗透液中分离得到的菌株，进行生理实验和特异性PCR扩增反应来分离筛选鉴定得到短小芽孢杆菌。通过单因素实验确定了短小芽孢杆菌所需的最适培养基组分，通过正交实验确定出最适培养基组分的最佳配比。在最适培养基的基础上，进行发酵培养，优化最佳发酵条件。得到短小芽孢杆菌生长所需的最优培养基及最佳发酵条件。从垃圾渗透液中分离得到的菌株细胞呈现杆状，革兰氏阳性，通过对菌株进行特异性PCR扩增反应，分析电泳结果图，确定菌株为短小芽孢杆菌。该方法可以方便、快捷地分析检测出短小芽孢杆菌，避免了进行16SrRNA基因序列的测序以及数据库比对分析的步骤。通过单因素实验确定了短小芽孢杆菌最佳培养基的成分为：玉米淀粉，酵母提取物，MgSO4·7H2O。利用正交实验设计优化了短小芽孢杆菌的培养基，得到最适培养基为：玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，MgSO4·7H2O0.49%，小牛浸膏0.3%，NaCl0.5%。并通过单因素实验法确定了最佳培养条件，温度37℃，初始pH7.2，接种量为5%。采用最优培养基和基础培养基分别在摇瓶发酵培养条件下培养10h。测得OD320值由1.44增长为6.93。生长量提高了将近4.8倍。通过筛选得到的短小芽孢杆菌需要制成制剂大量投入使用。芽孢比营养细胞易保存，复活率高，是影响短小芽孢杆菌制剂效果的关键因素是芽孢的含量，因此要研究得到形成芽孢的条件。有报道培养基中含有锰离子对短小芽孢杆菌形成芽孢是有利的，一定浓度的锰离子可以促进菌体和芽孢的生长。所以本实验对不同浓度锰离子对短小芽胞杆菌的芽胞产率的影响进行了研究，以期在活菌含量高的同时获得较高的芽胞产量，为短小芽孢杆菌制剂的产业化生产提供基础。经研究得到在最优培养基中加入0.007%的Mn2+能够提高活菌数和芽孢数，此时芽孢率最大。
【作者】孔高飞；
【导师】刘小川；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】垃圾渗透液；短小芽孢杆菌；鉴定；培养条件优化；

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