柞蚕滞育关联蛋白2的表达与分子特性的研究

【摘要】昆虫滞育关联蛋白（DAP）是在研究昆虫滞育过程中发现的一类与昆虫滞育的发生和维持有关的蛋白。目前为止，关于昆虫DAP的研究甚少，对其分子特性及其如何参与滞育过程尚不清楚。本研究从NCBI获取柞蚕滞育关联蛋白基因2（diapause-associatedprotein2，dap2）的序列，GenBank登录号为JQ003184.1。比对分析发现，DAP2与烟草天蛾和家蚕眼色素结合蛋白（OBP）同源性可达到56%和57%，推测其可能是一种OBP。信号肽和亚细胞定位预测结果表明，DAP2可能有信号肽，为分泌型蛋白，这与其携带和转运色素功能相符。蛋白质高级结构预测其内部可能形成一个眼色素结合位点。液氮研磨柞蚕蛹脂肪体组织，利用TRIzolReagent提取RNA，利用RT-PCR扩增得到dap2基因片段（去掉预测信号肽的序列）的并克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组表达载体pET-28a(+)-dap2，在E.coliBL21(DE3)诱导表达重组DAP2。经SDS-PAGE分析有一大小30kD特异性蛋白条带表达，与预期值相符，经质谱鉴定正确。进一步利用镍柱亲和层析纯化该蛋白，并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，Westernblot检测抗体特异性较高。继而利用荧光定量PCR及Westernblot检测柞蚕各发育时期及各组织的dap2基因的转录和表达情况。结果表明，滞育期dap2基因的转录和表达水平最高，其次是在非滞育蛹期和五龄幼虫中，这与DAP与滞育过程相关相吻合。五龄幼虫脂肪体中dap2基因的转录水平最高，血淋巴中DAP2表达水平最高，这提示DAP2可能在脂肪体中合成后分泌到血淋巴中。为了进一步阐明DAP2的分子特性，本研究从非滞育蛹血淋巴中分离纯化到纯度约94%的DAP2蛋白。全波长扫描测定发现其在可见光范围内不存在特异的吸收峰，PNGaseF特异性地切割N-糖链，DAP2分子量减少2kD左右，表明该蛋白为糖蛋白。双向电泳并结合质谱鉴定结果表明纯化后的蛋白存在三个不同的点，且都为DAP2蛋白，表明其在柞蚕体内存在至少三种不同的翻译后修饰。上述结果表明DAP2与柞蚕的滞育活动相关，并且具有部分OBP的类似性质，DAP2的具体作用机制及与OBP的内在联系尚不清楚，本研究工作为进一步分析该蛋白在昆虫滞育中的作用奠定了基础。
【作者】杨晓丽；
【导师】陈健；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】柞蚕；dap2；表达谱分析；分子特性；

【参考文献】
[1]许晶.西江油田群海管合并项目进度管理研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[2]许玉谋.双层石墨烯的等效弹性参数及力学行为分析[D].上海交通大学,2013.
[3]冯夏勇.中国汽车零部件工业的发展空间[J].中国机电工业.2004(11)
[4]朱明英.Ca-Al-LDH深度处理垃圾渗滤液生化尾水的应用研究[D].上海大学,环境工程,2014,硕士.
[5]姜伟.自动测试系统中PCB数据处理技术的研究与实现[D].中北大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[6]邢健飞.基于三维人脸建模的多视角人脸识别方法研究[D].杭州电子科技大学,模式识别与智能系统,2014,硕士.
[7]陈佳.巨型钢框架—预应力拉索支撑体系的力学性能及施工顺序分析[D].江苏科技大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[8]刘海港.基于混合偏振矢量光束的光学囚笼研究[D].上海大学,无线电物理,2013,硕士.
[9]赵春凤,刘群.电力生产系统OLAP与数据挖掘技术的实现[J].哈尔滨工程大学学报,2002,03:82-86.
[10]李治.中国化工产品遭遇美国反倾销制裁的原因分析及对策研究[D].浙江工业大学,2009.
[11]王星磊.金属掺杂硼纳米材料的储氢性能研究[D].山西师范大学,2013.
[12]陈磊.地理教师实践性知识的叙事研究[D].山西师范大学,教育学原理,2013,硕士.
[13]尹淑媛.“文革”时期歌曲宣传研究[D].辽宁大学,新闻学,2012,硕士.
[14]林秋美（LIEMMEILIANESUSANTI）.在厦印尼留学生适应性及学习情况研究[D].厦门大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[15]肖卉.英语会话中不定表达的指示用法[D].南昌大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[16]陈杰明.基于GOOSE的10kV简易母线保护研究和应用[J].电力系统自动化,2011,04:96-99.
[17]张同功.中外独立董事制度的比较与借鉴[D].中国海洋大学,金融学,2003,硕士.
[18]任雅洁.论五四时期的男女同校问题[D].河北师范大学,中国近现代史,2004,硕士.
[19]孙士觉.古越汉禅诗研究[D].广西师范大学,古代文学,2003,硕士.
[20]贺嘉玉.G矿井建设工程项目安全事故预防与控制研究[D].西安科技大学,工商管理,2014,硕士.
[21]梁瑞格.唐代见危不救罪研究[D].郑州大学,法律史,2013,硕士.
[22]贾荣.不确定采样数据系统的稳定性分析[D].内蒙古大学,数学,2014,硕士.
[23]俞强.GRIN聚合物微球用作回归反射材料的研究[D].安徽大学,光学,2004,硕士.
[24]王海.基于激光雷达的自动泊车环境感知技术研究[D].大连理工大学,车辆工程,2013,硕士.
[25]刘鹏.混凝土自锚式悬索桥加劲梁预应力损失及其影响研究[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[26]王宇.农村初中留守儿童母亲教养方式、学业自我概念与学习成绩的关系研究[D].首都师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[27]陈志仁.曲轴锻造过程金属流动与微观组织演化规律的数值模拟研究[D].山东大学,材料加工工程,2013,硕士.
[28]李伟.Copula函数在多变量洪水联合分布中的应用研究[D].华中科技大学,水利工程,2013,硕士.
[29]李光钰.基于都市农业理念的城市建筑生态设计探究[D].上海交通大学,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[30]庞佳音.论英国法上的合同相对性原则及其例外与规避[D].对外经济贸易大学,法律,2004,硕士.
[31]杨波.论董事责任保险[D].吉林大学,民商法学,2004,硕士.
[32]钟俊飞.简支体系桥面连续病害防治技术研究[D].哈尔滨工业大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[33]何文勇.基于光谱与纹理的高光谱影像半监督降维与融合研究[D].上海大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[34]孙鹏.多系统下DLNA数字家庭网络人机交互系统的设计与实现[D].南京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[35]周昱.肝动脉导管栓塞新辅助化疗大肠癌肝转移的临床分析[D].苏州大学,外科学,2013,硕士.
[36]檀革银,靳向煜.功能性非织造材料在服装领域的应用[J].宁波服装职业技术学院学报.2002(02)
[37]王笑涵.网络中英语新词的构词法及翻译技巧[D].吉林大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[38]徐凤先.基于积极心理学的发展性艺术治疗研究[D].山东艺术学院,艺术学,2012,硕士.
[39]张思.英语写作成绩与连贯的关系研究[D].首都师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[40]廉海红.平肝育阴清热法治疗干眼症疗效观察[D].北京中医药大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[41]徐俊斌.一种荧光手术导航目镜系统的设计与应用研究[D].中国科学技术大学,精密仪器与机械,2014,硕士.
[42]许锦凤.离子液体在水中的存在状态及离子液体水合作用的研究[D].辽宁大学,无机化学,2012,硕士.
[43]谢光汉,伍朝晖,符曦,蔡自兴.附加力外环的机器人力/位置自适应模糊控制[J].控制与决策,1999,02:65-68.
[44]胡玮.安庆沿江湿地的资源与环境特征研究[D].安徽师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[45]李维彦.利用测井资料分析裂缝充填特征与古应力场研究[D].长江大学,地球探测与信息技术,2014,博士.
[46]萧蕴诗,吴启迪,韩生廉,许维胜,汪镭.并行工程环境下模糊多目标决策的神经网络模拟[J].控制与决策,1997,05:610-613.
[47]NamanCissoko.Ozonation-biological Treatment of Dyeing and Phenol-containing Wastewater[D].浙江大学,环境工程,2004,硕士.
[48]孙洪斌.高压大容量H桥串联型变频器的研究[D].西安建筑科技大学,机械工程,2004,硕士.
[49]孙艳平.我国房地产上市公司财务风险评价研究[D].石家庄经济学院,企业管理,2013,硕士.
[50]田永胜.手持移动设备自然用户界面交互范式研究[D].西北大学,计算机应用技术,2014,硕士.