细胞内表达海洋来源的UPL1/AJL1/HdSABL基因抗肿瘤作用的机制研究

【摘要】癌症是威胁人类健康的主要疾病之一。与正常细胞相比，癌细胞内很多蛋白的糖基化发生改变。凝集素是一种糖类识别蛋白，可以特异性识别并结合特定的糖蛋白或糖脂，并通过糖类复合物调节细胞的生长、分化、信号传递、细胞迁移、凋亡、免疫调节等生物过程，已被应用于免疫学、肿瘤和细胞生物学等诸多方面的研究。之前，本课题组将掌叶半夏凝集素（Pinelliapedatisectaagglutinin，PPA）基因转入癌症细胞，发现PPA可与蛋白精氨酸甲基转移酶5(proteinargininemethyltransferase5，PRMT5)结合，最终进入细胞核导致肿瘤细胞死亡。研究提示凝集素超家族中可能蕴藏抗癌基因。海洋凝集素种类繁多，可识别各种糖类，本文中选取海洋生物孔石莼(Uivapertusa)N-乙酰葡糖胺凝集素UPL1、盘鲍鱼（Haliotisdiscusdiscus）唾液酸凝集素HdSABL以及日本鳗鱼(Anguillajaponica)半乳糖凝集素AJL1，将基因导入肿瘤细胞，在细胞水平上研究它们的毒性及机制。将AJL1、HdSABL、UPL1基因克隆到真核载体pEGFP-C1中，观察其蛋白在恶性肿瘤细胞内的亚细胞定位，并构建携带AJL1、HdSABL、UPL1基因的复制缺陷型腺病毒（AD-FLAG-AJL1，AD-FLAG-HdSABL及AD-FLAG-UPL）与对照病毒AD-FLAG，并在体外测定其对多种癌细胞的杀伤效果，探索其在细胞内的抑癌作用机理。本论文研究可为癌症基因治疗提供新的治疗基因。方法（1）构建pEGFP-GENE-C1系列真核表达载体；（2）荧光显微镜观察，筛选对癌细胞有毒性的凝集素；（3）激光共聚焦观察其在癌细胞的亚细胞定位；（4）利用Adeasy系统包装重组腺病毒AD-FLAG，AD-FLAG-AJL1，AD-FLAG-HdSABL及AD-FLAG-UPL；（5）MTT法检测病毒对多种癌细胞株生长的抑制作用；（6）细胞形态学观察几种腺病毒对几种癌细胞株的杀伤作用；（7）AnnexinV/PI流式细胞术检测病毒诱导Hep3B细胞的凋亡；（8）Westernblot方法检测细胞凋亡相关的信号分子。结果（1）成功构建pEGFP-GENE-C1系列真核表达载体，并使用Adeasy系统成功构建了携带凝集素AJL1、HdSABL、UPL1基因的腺病毒；（2）荧光显微镜观察其在癌细胞的表达，发现AJL1、HdSABL和UPL1三种凝集素都含有细胞毒性；（3）激光共聚焦实验观察在癌细胞内的亚细胞定位，表明AJL1的表达会使细胞收缩，UPL1、HdSABL表达前期呈散点状分布在细胞质及细胞器中，但最终都进入细胞核；（4）MTT、形态学观察实验证实AJL1、HdSABL、UPL1基因表达对癌细胞具有显著的杀伤作用；（5）AnnexinV/PI流式细胞术实验得出AJL1和HdSABL可诱导Hep3B细胞发生凋亡，UPL1则不能；（6）Westernblot结果发现HdSABL可通过下调凋亡抑制因子Bcl-2诱导细胞凋亡结论实验结果表明，在癌细胞内AJL1、HdSABL、UPL1蛋白的表达可以导致细胞死亡，其中，HdSABL可下调凋亡抑制因子Bcl-2引发细胞凋亡，AJL1也可诱导细胞凋亡。AJL1、HdSABL和UPL1有可能成为新的癌症治疗基因。
【作者】杨新燕；
【导师】李恭楚；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】癌症；凝集素；N-乙酰葡糖胺凝集素；唾液酸凝集素；半乳糖凝集素；复制缺陷性腺病毒；

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