颗粒裂解肽G13结构域及牛乳铁蛋白肽酿酒酵母分泌表达体系构建

【摘要】牛乳铁蛋白肽(BovineLactoferricin,LfcinB)是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶作用后从N-末端释放的结构域,含25个氨基酸残基,具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫等作用。由于其天然来源有限,人工化学合成价格昂贵如何通过基因工程技术生产LfcinB,以满足研究和应用的需要,成为研究的热点。本实验根据酿酒酵母密码子偏好设计LfcinB基因片段,人工合成LfcinB基因并构建重组质粒pYES2-α-LfcinB,转化到大肠杆菌DH5a中扩增。提取纯化重组质粒并将其转化到酿酒酵母宿主菌INVScl中,通过尿嘧啶缺陷筛选培养基筛选被转化的酵母菌,接种于尿嘧啶缺陷选择培养基摇瓶培养,添加半乳糖诱导表达目的蛋白。通过抑菌试验研究LfcinB的性质,并根据抗生素微生物效价测定法中的管碟法一剂量法测LfcinB的微生物效价,结果表明：重组表达质粒pYES2-α-LfcinB经双酶切和测序证明构建正确,收集浓缩诱导后的蛋白进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测,证实目的蛋白的存在。抑菌活性试验表明,重组LfcinB对大肠杆菌和枯草杆菌都有明显的抑菌活性,对LfcinB的诱导表达条件优化结果表明,在诱导温度为26℃、诱导剂半乳糖浓度为3%的条件下诱导96h时表达产量最高,对LfcinB的性质研究表明其具有热稳定性且LfcinB中二硫键的存在对其抑菌活性没有影响,本实验成功在酿酒酵母中分泌表达了具有活性的LfcinB,为进一步研究LfcinB的生物功能及应用开发奠定了基础。G13结构域是Granulysin中,含19个氨基酸残基以及α-螺旋结构、1oop结构,抗菌肽G13具有较多的正电荷与稳定的两性α-螺旋有助于提高杀菌活性,具有重要的研究价值。本实验对颗粒裂解肽G13在酿酒酵母中的表达条件进行了优化,并对G13的性质进行了研究,结果表明,用部分甘油代替棉子糖对宿主菌的生长及对G13的表达没有影响,颗粒裂解肽G13具有热稳定性,G13耐酸不耐碱。牛乳铁蛋白肽LfcinB和颗粒裂解肽G13的分子量都比较小,表达产量都不高,本研究通过构建重组pYES2-α-LG质粒,之后电击转化酿酒酵母INVScl感受态细胞,通过半乳糖诱导表达获得大量的杂合抗菌肽LfcinB-G13。抑菌活性表明其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有明显的抑菌活性,其抑菌活性比相同表达体系表达的LfcinB和G1的抑菌活性都要高,表达产量也有所提高,具有重要的应用价值。当利用质粒载体大量而高效的表达蛋白质时,质粒载体丢失即意味着产量的下降,进而给生产带来非常严重的后果。因此,质粒载体的不稳定性现象是一个亟待解决的问题。本实验通过硫酸二乙酯诱变含重组质粒pYES2-α-G13的工程菌,之后用五氟尿嘧啶筛选出突变株,经过PCR验证在没有选择压力的SC培养基上质粒仍旧具有稳定性。
【作者】马利娟；
【导师】查向东；
【作者基本信息】安徽大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】牛乳铁蛋白肽；颗粒裂解肽G13；酿酒酵母表达系统；分泌表达；抑菌活性；诱变；

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