热应激对草鱼肾细胞凋亡的影响

【摘要】本论文研究热应激对草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的肾细胞系(Ctenopharyngodonidelluskidneycells,CIK)凋亡的影响。设置4个不同的实验温度来培养细胞：28℃.32℃.36℃.40℃,其中的28℃是CIK细胞最适生长温度,将这个温度组的细胞作为对照组。用上述温度对细胞进行2h的急性热应激和24h连续热应激处理,每实验组3个重复,检测细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率、细胞周期、细胞凋亡率、细胞DNA断裂情况、多泛素蛋白的表达量以及凋亡相关的基因caspase-3和bcl-2的表达量等指标,并对细胞形态的变化进行了观察。主要研究结果如下：1.急性热应激对CIK细胞的影响在不同温度的急性应激作用下,细胞存活率随着处理温度的升高均有显著性(p<0.05)的下降;乳酸脱氢酶的漏出率随着应激温度的升高而增加,36℃和40℃比对照组显著(p<0.05)的增多；急性热应激处理后对细胞内多泛素蛋白和凋亡相关基因表达的检测发现,随着应激温度升高细胞内多泛素蛋白的表达量增加,并且36℃和40℃组的蛋白表达比对照组显著(p<0.05)的升高；凋亡基因caspase-3随着应激温度的升高表达量增多且36℃和40℃组与对照组有显著性差异(p<0.05),bcl-2随着应激温度的升高表达量降低,且32℃和40℃处理组与对照组有显著性差异(p<0.05),Bcl-2蛋白表达量逐渐降低。流式细胞仪检测细胞周期没有规律的变化。热应激处理后的细胞经过荧光染色后显微镜观察发现,部分细胞的胞质中出现空泡,也有细胞核固缩的现象发生。实验结果说明较高温度的急性热应激会破坏细胞膜,使细胞膜的通透性增加,同时也会降低细胞活性,多泛素蛋白表达的增加说明热应激使细胞受到了损伤,凋亡相关基因cnspase-3和bcl-2的表达变化也说明细胞的凋亡通路开启了,但各处理组的细胞没有大规模的凋亡发生,并且发生的凋亡对处于不同分裂时期的细胞没有选择性。2.连续热应激对CIK细胞的影响细胞热应激处理2h、6h、12h、24h,热应激处理的温度越高细胞活力下降的越快,处理6h的40℃组与28℃相比显著性下降(p<0.05),12h和24h各个处理组与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。LDH的漏出率与热应激的处理时间和处理温度均成正比,6h和24h的40℃处理组与对照组相比有显著性(p<0.05)的升高。热应激处理12h和24h后流式细胞仪检测细胞凋亡率,各个处理组细胞凋亡率基本上是随着热应激温度升高而增加的。而对热应激后细胞DNA的断裂情况的检测发现热应激后细胞的DNA会有一定的损伤。透射电镜观察发现热应激后的细胞胞质空泡化比较严重。实验结果说明：连续的热应激亦会对细胞造成一定的损伤,损伤细胞膜和细胞器并且热应激会造成细胞活性的下降,同时较长时间的热应激会造成细胞凋亡率的增加,温度热应激后可检测出DNALadder即小片段的DNA增多,说明热应激会造成DNA的断裂,这也是细胞凋亡的标志之一。
【作者】童娜；
【导师】李大鹏；汤蓉；
【作者基本信息】华中农业大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】热应激；草鱼肾细胞系；细胞凋亡；斑点杂交；天冬氨酸蛋白水解酶-3；

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