低氧胁迫对鲢线粒体ATP酶活性及β、γ、δ亚基表达的影响

【摘要】线粒体ATP酶是机体生命活动中供能的关键酶,它有F1和F0两部分组成,在结合状态下具有合成ATP的活性,而在分离状态下具有水解ATP的活性,ATP的水解能够驱动F1的转动,跨膜的质子流能促进F0的转动,因此ATP酶通过F1和Fo两部分的有序配合,从而合成维持机体正常生命活动所需的能量供给。鲢(Hypophthalmichthysmolitrix),俗称白鲢、跳鲢、水鲢、鲢子,隶属于鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),是我国著名的四大家鱼之一,已成为我国主要养殖的淡水鱼类之一。鲢由于性情活泼,喜跳跃,耐低氧能力较差,环境剧烈变化时易发生大水面积的浮头泛塘现象,因而选育耐低氧鲢品种(系)已经成为鲢新品种选育的重要研究课题之一。低氧状态下,由于供氧不足,线粒体中的氧化磷酸化反应受阻,不能及时有效的合成ATP,造成能量代谢受阻,无法满足鱼体对ATP正常的生理需求,鱼类游动缓慢,当缺氧严重时,会导致鱼类的死亡。本文旨在通过RACE技术对鲢线粒体ATP酶F1部分p、γ、6亚基基因的克隆,采用SYBR-greenⅠ荧光定量PCR技术对其在低氧胁迫过程中鲢各组织中的表达,及通过寡霉素抑制法对鲢线粒体ATP酶活性的变化情况等进行分析,为进一步阐明鲢低氧胁迫下线粒体ATP酶及F1各亚基的反应机制提供一定的理论数据。本研究的主要实验结果如下：1.低氧胁迫对鲢线粒体ATP酶活性的影响随着水体溶氧(DO)的逐渐降低,鲢心脏、脑、肝、脾和肌肉中线粒体ATP酶活性均呈现先上升后降低的趋势,但不同组织中的变化情况不尽相同。当DO为3.37mg/L时脑组织中线粒体ATP酶活性达到最高值,且显著高于正常溶氧情况下的表达水平；心脏和肌肉组织在DO为2.11mg/L时ATP酶活性达到最高峰值,均显著高于正常溶氧时的表达水平；当鲢出现浮头现象时(DO：1.12mg/L)其肝和脾脏组织中线粒体ATP酶活性出现最高峰值,显著高于正常溶氧时的表达水平。2.鲢线粒体ATP酶p基因cDNA的克隆及表达鲢线粒体ATP酶β基因cDNA序列全长为1768bp,开放阅读框(ORF)为1557bp,编码518个氨基酸。p是一个保守基因,其氨基酸序列与鲤鱼的同源性达到了99%,与斑马鱼、青鳉、尼罗罗非鱼、红鳍东方鲀等分别为98%、98%、97%、97%。随着DO的降低,鲢心脏、脑、肝、脾和肌肉组织中F1-β基因mRNA的表达呈先升高后降低的趋势。当DO从正常溶氧降低到2.11mg/L过程中,p基因在心脏和脑中的表达量显著升高(P<0.05),之后随着DO的继续降低呈现急剧下降；肝、脾和肌肉中当DO降低到3.37mg/L过程中β的表达显著升高(P<0.05),之后急剧下降(P<0.05)。3.鲢线粒体ATP酶γ基因cDNA的克隆及表达鲢线粒体ATP酶γ基因cDNA序列全长1154bp,ORF为879bp,编码292个氨基酸。其氨基酸序列与斑马鱼的同源性达93%,其次与鲤、蓝鲶鱼、斑点叉尾鮰、大西洋鲑鱼等分别达92%、92%、91%、86%。随着DO的降低,在脑、肝和肌肉中γ基因的表达呈现先升高后降低的趋势,当DO为2.11mg/L时,脑和肝脏中γ基因表达量最高,显著高于正常溶氧下的表达(P<0.05),而在肌肉中,当DO为3.37mg/L时γ表达量最高,且显著高于正常水平(P<0.05)；心脏中γ基因的表达呈逐渐降低趋势,显著低于正常表达(P<0.05)；相反在脾中则呈现逐渐升高的趋势。4.鲢线粒体ATP酶δ基因cDNA的克隆及表达鲢线粒体F1-δcDNA序列全长为762bp,ORF为480bp,编码159个氨基酸。其氨基酸序列与斑马鱼的同源性最高,达到了91%,与大西洋鲑、罗非鱼、樱花钩吻鲑、红鳍东方纯等的同源性分别为84%、85%、84%、84%。随着DO的逐渐降低,鲢F1-δmRNA的表达在心脏中呈现持续下降的趋势,且与正常溶氧情况下的表达相比,有显著差异(P<0.05)；在脑、肝、脾和肌肉中的表达先呈现上调现象,且与正常DO下的表达有显著差异(P<0.05),随后表达下调与正常DO组无显著差异,其中在肝和脾组织中当其表达量达到最高时,显著(P<0.05)高于正常DO组数十倍。5.ATP酶活性与F1复合体中p、γ、δ亚基的关系由以上实验结果可知鲢线粒体ATP酶F1复合体中p、丫、6亚基均具有高度的保守性,ATP酶中具有催化作用的p亚基,随着DO的逐渐降低,其表达变化与ATP的活性的活性的变化一致,p亚基的表达变化可反应出ATP酶活性的变化。γ、δ亚基的表达均受到DO降低的影响,其表达变化与ATP酶活性的变化在一些组织中存在差异。
【作者】王春枝；
【导师】邹桂伟；
【作者基本信息】华中农业大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】鲢；低氧胁迫；ATP酶；基因克隆；表达；

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