hDⅡ1~(ext)-Fc融合蛋白在CHO-S细胞的表达纯化与初步鉴定

【摘要】Notch基因首先在果蝇体内发现,由于该基因的缺失会导致果蝇翅膀边缘出现缺口(notch)而得名。Notch信号传导通路广泛存在于脊椎与非脊椎动物体内,它是决定细胞命运的重要路径之一[1]。Notch受体是由胞外区(extracellularNotch,ECN)和跨膜区／胞内区(Notchtransmembrane,NTM)两个亚基组成的异二聚体,二者是通过共价键结合在一起的,并具有Ca2+依赖性[2]。哺乳动物中有多重Notch配体,与Delta高度相似的配体称为Delta或Delta样(Delta-like,D11),与Serrate相似的称为Serrate或Jagged。目前发现人的notch配体共有5种,即Delta-like-1,Delta-like-3,Delta-like-4,Jaggedl,Jagged2。作为人重要Notch配体之一的Delta样配体1是由723个氨基酸组成的单次跨膜蛋白,其中胞外区含有539个氨基酸,由1个N端保守的DSL(Delta/Serrate/Lag2)基序和8个表皮生长因子样重复序列(epidermalgrowthfactor-likerepeats,EGF-R)结构域组成,具有重要的生物学活性[4]。该DSL结构域结合Notch受体,促进受体异二聚体分离,进而受体活化激活下游信号,Notch受体经过三次剪切,最终胞内区释放到细胞核,激活发状分裂相关增强子(hairyandenhancerofsplit,Hes)等靶基因的转录,进而调节细胞分化和组织发生[5]。胞内域功能还不太清楚,有研究表明Deltal的胞内区能够诱导细胞的生长抑制[6]。近几年研究表明Notch信号传导通路与肿瘤发生有关,如PurowBW等人在2005年发现Notchl及Notch4配体Delta-like-1、Jaggedl在多种神经胶质细胞瘤中过度表达,并且在联合其他细胞因子的情况下,hDll1胞外区可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖[7]。鲁茁壮等克隆表达了人Notch配体Delta-like-1(hDll1)的胞外区,并经过集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞具有扩增作用[8]。终上所述,根据已知序列,将合成hDll1ext基因片段经PCR扩增,Nhel和BamHI双酶切后连接至pIRES2-EGFP-Fc中,取连接产物转化感受态细胞,涂于含有kana+抗性的LB固体筛选培养基上,倒置过夜,次日挑选阳性克隆,经菌落PCR验证正确后测序,将正确的重组质粒转染至CHO-S细胞,经G418筛选高表达细胞系,利用rProteinA亲和柱纯化目的蛋白,并通过检测Notch下游信号分子Hesl的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。结果筛选得到了高效表达hDll1ext-Fc的CHO-S细胞株10C7,经WAVE培养密度最高达到6.27×106cells/mL,培养近2周后,细胞大量死亡收得上清体积约1.1L,测定上清中目的蛋白浓度为47.8μg/mL估计得到总目的蛋白为52.58mg。将上述上清经rProteinA亲和柱纯化获得较高纯度的融合蛋白,BCA试剂盒测得蛋白浓度为1.5mg/mL,体积为30mL,最终得到的目的蛋白总量为45mg,可以得到rProteinA亲和柱回收率为45mg/52.58mg=85.6%。配合生物活性检测实验显示,可溶性的hDll1ext-Fc能够激活Hesl报告基因,并且能上调Notch下游分子Hesl的表达,证实其可以激活Notch通路。本实验通过纯化获得的较高纯度的具有生物学活性的hDll1ext-Fc融合蛋白,为后续研究它的功能奠定了重要基础。
【作者】潘芸；
【导师】胡显文；
【作者基本信息】安徽大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】hDll1ext-Fc；CHO-S细胞；Fc融合蛋白；

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