Exendin-4/HSA长效融合蛋白的构建表达与活性研究

【摘要】糖尿病是多因素所致的内分泌紊乱性疾病,主要有1型(胰岛素依赖型)和2型(非胰岛素依赖型)糖尿病。据预测,到2025年全球糖尿病患者人数将达3亿,其中90%为2型糖尿病。2型糖尿病的传统治疗药物主要有二甲双胍、磺脲类药物等,这些药物的长期使用会导致胰岛细胞功能衰竭,不能有效控制病情发展。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepolypeptidel,GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肽类激素,能够刺激胰岛素的分泌、增加胰岛素的生物合成,通过调节胰岛素和胰高血糖素的分泌而影响葡萄糖代谢,对糖尿病有很好的治疗效果。促胰岛素分泌肽(Exendin-4,E4)是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一个激素物质,由39个氨基酸组成,与GLP-1相似性高达53%,并且生物学效应也几乎完全一致。它能增加胞内cAMP浓度,刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌,抑制p细胞凋亡,刺激p细胞的增殖与新生,还具有降低饥饿及餐后血糖浓度和胰高血糖素浓度等生物学效应；E4的半衰期为2-3h,远长于GLP-1的1-2min,稳定性和生物活性也明显高于GLP-1,具有更好的治疗效果。但作为糖尿病的治疗药物其半衰期仍较短,且天然产物含量较少,而化学合成的方法存在成本高、步骤多、收率低、合成过程涉及有害化学物质等缺点,尚无法满足大规模的临床需求。相关的研究表明通过基因工程方法构建长效融合蛋白既能够延长Exendin-4的半衰期,又可大大降低生产成本。本实验的研究目的主要是利用合成生物学中的BglBrick方法将优化后的Exendin-4基因与HSA基因进行不同方式的融合表达,通过体外活性检测筛选候选长效融合蛋白。使所获的长效融合蛋白能够在高效发挥生物学功能的前提下,延长在血浆中的半衰期,最终提高治疗效果。主要研究内容及结果包括：1.以pHI_D2_HSA/IFN质粒为模板,通过PCR扩增(在扩增引物的上下游分别添加XhoⅠ、BglⅡ和NotⅠ、BamHⅠ酶切位点)获得引入相应酶切位点的HSA基因片段,连入表达载体质粒pPICZαA上,构建出pPICZaA-HSA表达载体。2.通过NCBI数据库中检索到编码Exendin-4开放阅读框序列,根据毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化后,在片段的两端分别添加(?)hoⅠ,BglⅡ和BamHⅠ、NotⅠ酶切位点,人工合成,连入表达载体质粒pPICZαA上,构建出pPICZαA-E4表达载体。3.利用合成生物学中的BglBrick方法以pPICZαA-HSA和pPICZαA-E4两表达载体作为基础表达载体构建出十种不同形式的Exendin-4/HSA融合蛋白表达载体,将线性化后的表达载体用电转化方法转化入毕赤酵母KM71H基因组中,用甲醇诱导表达,所获菌液上清经过SDS-PAGE分析,都分别获得相应的目的蛋白。4.对于诱导表达的目的蛋白分别经疏水层析、阴离子层析或亲和层析进行分离纯化,最终获得了纯度达90%以上的其中八种目的蛋白。5.以GLP-1蛋白作为阳性药物,用MTT方法检测对RIN-m-5F、MIN6细胞增殖的影响、用ELISA方法检测对INS-1、MIN6细胞胰岛素分泌量的影响、用ELISA方法检测对BHK-GLP-1R细胞cAMP分泌水平的影响,通过对上述方法的综合比较,建立了用ELISA方法检测目的蛋白对MIN6细胞胰岛素分泌量的体外生物活性活性测定方法,该方法效果最好、步骤简单、重复性好,适用于融合蛋白的体外生物活性检测。6.使用胰岛素检测方法评价所获的八种长效融合蛋白体外生物活性。将终浓度为250μg/mL的八种目的蛋白,作用处于对数期的MIN6细胞,2h后,用胰岛素试剂盒检测细胞培养液中胰岛素分泌量的变化,实验结果表明八种长效融合蛋白对MIN6细胞的胰岛素分泌都有一定的刺激作用,其中(E4)4-HSA、E4-HSA-E4两种融合蛋白的作用效果最好,胰岛素的分泌量提高了41.06%、42.89%。本实验利用合成生物学中的BglBrick方法构建长效融合蛋白表达载体实现了Exendin-4/HSA长效融合蛋白的快速组装,BglBrick方法实现了能够随意的在不同基因的任意末端连接任意个数的其他基因。长效融合蛋白表达载体电转化入毕赤酵母菌KM71H后,经过甲醇的诱导,十种表达载体均表达出相应的融合蛋白,为长效融合蛋白的快速构建提供了新的思路。将诱导后的菌液进行分步分离纯化后都获得了高纯度的长效融合蛋白,方便后续体外生物活性的测定。筛选建立的胰岛素检测方法实验效果明显,重复性好,适用于融合蛋白体外生物活性的评价。体外生物活性的评价结果为后续融合蛋白的体内生物活性测定奠定了基础。
【作者】邵妤；
【导师】陈惠鹏；
【作者基本信息】安徽大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】BglBrick；Exendin-4/HSA融合蛋白；合成生物学；

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