三孢布拉氏霉菌对三孢酸响应机制的研究

【摘要】通过微生物发酵法生产的类胡萝卜素具有成本低、产品纯度高、无毒副作用等优势。三孢布拉氏霉菌是目前工业化发酵生产类胡萝卜素的唯一的毛霉目真菌。前人的研究表明,三孢布拉氏霉菌强大的类胡萝卜素合成能力与其(+)、(-)菌结合过程中分泌的三孢酸的调控有很大关系。然而,目前三孢酸调控三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成的方式以及激活的类胡萝卜素合成途径与其他代谢途径之间的相互作用等问题仍然未知。为了研究三孢布拉氏霉菌对三孢酸的响应机制,我们测定了三孢酸加入三孢布拉氏霉菌(-)菌培养基后,(-)菌β-胡萝卜素、泛醌和麦角固醇的变化。三孢酸的添加增加了p-胡萝卜素和泛醌的含量,然而麦角固醇的含量在三孢酸添加的最初48h内保持不变,之后略有降低。之后我们使用气相色谱-质谱联用仪和多维数据分析技术进一步检测了三孢酸引发的三孢布拉氏霉菌胞内代谢物变化。通过主成分分析,我们发现了可以将对照组和三孢酸处理组分开的差异代谢物,并且使用了聚类分析进一步验证了这些差异代谢物。实验结果表明三孢酸是一种全局性的调控因子,其在代谢水平上的作用效果主要反映在几种脂肪酸、碳水化合物、氨基酸以及类胡萝卜素含量的变化上。碳代谢和脂肪酸代谢对三孢酸的添加更加敏感。甘油,谷氨酰胺,γ-氨基丁酸或许在三孢酸的调控中发挥重要作用。这些实验结果也说明三孢酸在代谢水平的调控除了涉及类胡萝卜素合成外,也涉及糖酵解、三羧酸循环支路、脂肪酸合成等多种代谢途径。之后我们从基于二维电泳的蛋白质组水平分析三孢布拉氏霉菌对三孢酸的响应机制。在加入三孢酸12h后,我们鉴定出了21个实验组和对照组之间的差异蛋白,包括焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、顺乌头酸酶、支链氨基酸氨基转移酶、泛素-蛋白连接酶、谷氨酰胺合成酶、腺苷酸琥珀酸合成酶、线粒体FAD转运蛋白等蛋白。研究结果表明,三孢酸在蛋白水平的调控包括核苷酸、氨基酸、碳水化合物和脂类的转运和代谢、能量产生和转化、翻译后修饰、蛋白翻译和周转,而类胡萝卜素的合成只是这众多代谢过程之一。我们继而分析了三孢布拉霉中涉及萜烯类物质合成的八个基因在三孢酸加入后转录水平的变化。其中四个β-胡萝卜素合成途径上的基因(ipi、carG、carRA和carB)在三孢酸添加后转录水平增强。这一结果表明三孢酸通过刺激转录增强萜烯类物质在三孢布拉霉中的合成,同时也表明基因ipi和carG在类胡萝卜素合成中扮演重要角色。我们克隆了上述来源于三孢布拉氏霉菌的基因ipi和carG的cDNA。它们编码的异戊二烯焦磷酸异构酶(IPI)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)是类胡萝卜素合成过程中的关键酶。将所克隆的ipi和carG在大肠杆菌中进行了功能表达。我们发现当上游的IPP活性增强时,基因工程E.coli需要更多的JGGPS活性来合成类胡萝卜素。三孢布拉霉的GGPS和IPI的引入使得基因工程Ecoli的β-胡萝卜素含量增加了89.2%。本研究为类胡萝卜素的遗传工程生产提供了新的基因来源。我们通过使用Tail-PCR技术克隆了受三孢酸调控的基因ipi和carG的部分启动子片段。在他们的启动子序列上发现了转录因子Ste11、Ste12和Mot3的结合位点,这些结合位点的存在或许与三孢酸的调控有关。
【作者】孙杰；
【导师】袁其朋；
【作者基本信息】北京化工大学，化学工程与技术，2012，博士
【关键词】三孢布拉氏霉菌；三孢酸；气质联用；二维电泳；代谢组分析；

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